RNAi沉默GTPBP4基因对结肠癌RKO细胞增殖及凋亡的影响

 目的 探讨GTPBP4基因沉默后,RKO细胞增殖和凋亡等生物学行为的改变。方法 将慢病毒GTPBP4-siRNA及CON053阴性病毒转染结肠癌RKO细胞株,以Real-time PCR 和Western blot检测敲减效率。Cellomics细胞计数检测细胞生长,MTT法检测细胞增殖,FACS法进行细胞周期检测,并进行细胞克隆形成实验,AnnexinⅤ-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 慢病毒成功感染RKO细胞,mRNA和蛋白检测均显示GTPBP4基因敲减成功。GTPBP4基因敲减后,RKO细胞增殖速率受到显著抑制,MTT值比值（即增殖倍数）减小,G_0/1、G₂/M期细胞显著增多,S期明显减少,细胞克隆集落数目减少,凋亡峰值明显高于对照组,且峰值出现时间早于对照组。 结论 GTPBP4基因可能通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡而影响结肠癌的发生发展。     

RNA干扰介导的Adrml基因沉默对大肠癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨RNA干扰使Adrml基因沉默后对大肠癌细胞增殖的影响.方法 构建靶向Adrml基因的shRNA真核表达载体,转染大肠癌细胞RKO,筛选Adrml基因沉默的稳定克隆.实验细胞分为3组,即稳定转染Adrml-shRNA的实验组、仅含大肠癌RKO细胞的空白对照组和转染空载体的阴性对照组.采用Western blot法检测Adrml蛋白的表达水平.通过软琼脂细胞集落形成实验观察3组细胞的集落形成能力.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和原位末端标记(TUNEL)法检测细胞的增殖和凋亡水平.应用流式细胞仪检测细胞周期的变化情况.结果 实验组大肠癌RKO细胞中,Adrml蛋白的表达受到明显抑制.实验组细胞的非贴壁依赖生长能力明显下降,偶见个别集落形成.实验组细胞的凋亡百分率为(12.4±1.1)%,明显高于阴性对照组[(1.3±0.2)%,P＜0.05].实验组G_0/G_1期和S/G_2期细胞所占的比例分别为(41.2±1.1)%和(58.8±1.1)%,实验组细胞被阻滞在G_1期.Adrml基因沉默能明显增强5-氟尿嘧啶(5-Fu)对大肠癌RKO细胞的生长抑制作用,并引起大肠癌RKO细胞大量凋亡.结论 RNA干扰介导的Adrml基因沉默能诱导大肠癌细胞发生凋亡并出现细胞周期阻滞,从而抑制肿瘤细胞的增殖.对于Adrml基因高表达的大肠癌患者,RNA干扰Adrml基因的表达并结合传统化疗有望成为新的治疗手段.     

香加皮宝藿苷-Ⅰ抑制结肠癌细胞株SW480 和RKO的恶性表型及其作用机制

目的：探讨香加皮宝藿苷-Ⅰ对人结肠癌细胞株SW480 和RKO增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响,并对其机制进行初步的探讨。方法：用不同质量浓度（0、5、10、20 μg/ml）的香加皮宝藿苷-Ⅰ溶液分别处理结肠癌细胞株SW480 和RKO,采用MTT法检测细胞的增殖情况,通过细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,通过Transwell 方法检测细胞的迁移和侵袭能力,通过流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。通过Western blotting 检测C-PARP、Bcl-2 与caspase-3 蛋白的表达水平,通过RNA-seq 检测分析香加皮宝藿苷-Ⅰ对SW480 细胞转录组的影响及其可能影响的信号通路。结果：香加皮宝藿苷-Ⅰ能抑制SW480 和RKO细胞的增殖、侵袭和迁移,并且能够诱导细胞凋亡和阻滞于细胞G0/G1期。香加皮宝藿苷-Ⅰ处理可上调SW480 和RKO 细胞株中C-PARP与caspase-3 蛋白的表达水平、下调Bcl-2 蛋白的表达水平;RNA-seq数据分析显示,SW480 细胞DNA复制及ERBB信号通路等相关基因的转录都受到香加皮宝藿苷-Ⅰ的影响。结论：香加皮宝藿苷-Ⅰ通过影响凋亡相关蛋白的表达、细胞DNA复制和ERBB信号通路来诱导细胞凋亡和细胞G0/G1期阻滞,进而抑制人结肠癌细胞株SW480和RKO的恶性表型。     

Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响

[目的]利用RNA干扰（RNAi）技术观测其对白血病K562细胞cyelin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒．通过壳聚糖介导转染K562细胞，Western blot分析检测转染前后cyclin D1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。[结果]构建靶向cyclinD1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshRNA-575）经壳聚糖转染后，能显著抑制cyelin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；细胞阻滞于G0／G1期，细胞凋亡明显。而m—pshRNA-790质粒并无上述生物学效应：[结论]cyclinD1基因表达下调可抑制K562细胞生长影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡提示，因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

姜黄素对人结肠癌细胞PI3-K/Akt和MEK/ERK信号通路的影响

目的:探讨姜黄素对人结肠癌RKO细胞PI3-K/Akt和MEK/ERK通路的影响。方法:MTT法检测细胞活力,Western blot检测p-Akt、Akt、p-ERK,ERK及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果:姜黄素作用人结肠癌RKO细胞,24h和48h的IC50值分别为51.69μg/ml和36.12μg/ml。选用50μg/ml的姜黄素分别作用24h和48h,RKO细胞凋亡百分比为26.79%和42.16%,与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。进一步检测发现姜黄素（50μg/ml）显著下调了p-Akt 和p-ERK的表达,同时Bcl-2与Bax的比值显著下调。结论:姜黄素可能通过抑制PI3-K/Akt和MEK/ERK信号通路的活化、下调Bcl-2与Bax的比值,从而抑制RKO细胞增殖和诱导细胞凋亡。     

siRNA干扰STAT3基因对食管癌Eca-109细胞生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3信号传导通路对人食管癌Eca-109细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:针对人STAT3基因mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,将其连入pRNAT-U6.1/neo质粒中,构建STAT3-siRNA表达载体,稳定转染人食管癌Eca-109细胞,利用RT-PCR、Western blot技术分别检测转染细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,MTT实验、流式细胞技术检测转染细胞的增殖、细胞周期和凋亡变化情况.结果:成功构建STAT3-siRNA表达载体,经测序鉴定正确.RT-PCR和Western blot结果显示,STAT3-siRNA3表达载体明显抑制了人食管癌Eca-109细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).MTT实验显示,稳定转染siRNA后,siRNA3实验组细胞的增殖能力明显下降,细胞生长抑制卒为35.68%,较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞技术显示,siRNA3实验组出现了细胞周期阻滞和细胞凋亡,细胞周期阻滞于G_0/G_1期,细胞凋亡率为13.26%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);结论:RNA干扰技术沉默STAT3基因可以有效地抑制STAT3基因的表达,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖,引起细胞周期G_0/G_1期阻滞,促进其凋亡.     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的:以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法:将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果:腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论:采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。      

沉默MCM7基因介导AKT信号通路参与黑色素瘤细胞增殖及凋亡的实验

目的 探讨MCM7基因沉默介导AKT信号通路参与人皮肤黑色素瘤细胞的增殖及凋亡。方法 构建MCM7基因和沉默MCM7基因表达的慢病毒RNA（LV-shRNA-MCM7）的表达载体;将A375细胞分为Control组、Empty vector转染组（空载质粒转染组）、siRNA（LV-shRNA-MCM7）转染组、siRNA NC（LV-shRNA-MCM7 negative control）转染组;MTT法检测每组细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡情况;划痕实验法检测细胞迁移能力;qRT-PCR法测定细胞中MCM7基因、AKT信号通路相关基因、Cyclin D1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3的相对表达量;Western blot法测定蛋白相对表达量。结果 沉默MCM7后,黑色素瘤细胞中的MCM7基因、CyclinD1、Bcl-2、AKT信号通路相关基因AKT3的mRNA和蛋白相对表达量显著下调（P<0.05）;凋亡相关基因Bax、caspase-3的mRNA和蛋白表达量显著上调（P<0.05）;siRNA转染组凋亡率显著上升,G₀/G₁期细胞数目明显增多,S期细胞数目明显减少;细胞增殖、迁移能力显著下降（P<0.05）。结论 沉默MCM7基因抑制AKT信号通路的激活,从而抑制A375黑色素瘤细胞增殖、迁移,促进A375黑色素瘤细胞凋亡。     

SEL1L3 通过对P53信号通路的影响促进结直肠癌细胞增殖

摘 要：［目的］ 探讨SEL1L3对结直肠癌细胞增殖的影响及其分子机制。［方法］ 分析TCGA数据库中结直肠癌样本SEL1L3表达水平,免疫组织化学染色检测结肠癌组织中SEL1L3的表达水平,Western blot及qPCR检测结肠上皮细胞及结肠癌细胞中SEL1L3表达水平。携带GFP的SEL1L3特异性敲除慢病毒感染RKO细胞,Western blot及qPCR验证SEL1L3敲除效率;荧光显微镜、MTT及平板克隆检测细胞增殖能力,Annexin Ⅴ检测细胞凋亡;细胞凋亡信号通路芯片检测SEL1L3敲除后相关基因的表达,并通过Western blot进行验证。CDX模型检测SEL1L3敲除后RKO细胞在裸鼠体内成瘤能力。［结果］ TCGA数据库分析结果显示SEL1L3在结直肠癌中表达显著高于正常组织。免疫组织化学染色结果表明,SEL1L3在结肠组织中表达显著高于正常组织（6.580±1.103 vs 1.390±0.263,P<0.01）,结肠癌细胞中SEL1L3的表达也显著高于正常结肠上皮细胞;细胞增殖实验结果表明,SEL1L3敲除后,细胞增殖能力显著降低（P<0.01）。Annexin Ⅴ检测结果显示,SEL1L3敲除后细胞凋亡明显增多（8.54%±0.41% vs 4.55%±0.27%,P<0.01）。裸鼠CDX模型结果则表明,SEL1L3能够促进RKO细胞在裸鼠体内的生长［（0.98±0.34） g vs（0.30±0.18） g,P<0.01］。细胞凋亡信号通路芯片及Western blot结果显示,SEL1L3表达敲除后,Caspase3（0.450±0.079 vs 1.160±0.115,P<0.01）及P53（0.290±0.018 vs 0.820±0.065,P<0.01）表达显著上调,而XIAP表达则显著下调（1.170±0.071 vs 0.330±0.034,P<0.01）。［结论］ SEL1L3通过上调XIAP表达和抑制P53及Caspase3信号通路,从而促进了结直肠癌的增殖。     

SCHIP1促进Hippo通路的激活抑制结肠癌的发生发展

目的:检测SCHIP1在结肠癌的组织和细胞中的表达水平以及其在结肠癌中对Hippo通路的影响。方法:利用TCGA数据库分析SCHIP1在结肠癌中的表达情况;免疫组化的方法检测SCHIP1在结肠癌组织标本中的表达情况;采用Transwell试验、集落实验及MTS检测对细胞迁移和增殖能力进行检测;采用Western blot检测YAP、P-YAP、CTGF在结肠癌中的表达情况。结果:TCGA数据库显示结肠腺癌中SCHIP1的表达低于正常组织;SCHIP1在结肠癌组织及细胞系中表达较低;SCHIP1过表达抑制了RKO细胞迁移和增殖能力;SCHIP1低表达促进了RKO细胞的迁移和增殖;过表达SCHIP1的RKO细胞明显抑制了YAP、CTGF的表达,促进了P-YAP的表达。低表达SCHIP1的RKO细胞促进了YAP、CTGF的表达,抑制了P-YAP的表达。结论:SCHIP1增强了结肠癌中Hippo通路活性,抑制结肠癌的发生进展;SCHIP1可能作为结肠癌治疗的一个潜在靶向分子。     

miR-143-3p通过靶向EZH2 调控结肠癌RKO细胞增殖、迁移和侵袭

目的：探讨miR-143-3p 通过靶向果蝇zeste 基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）调控结肠癌RKO细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法：选用2015 年3 月至2017 年7 月昆明医科大学第一附属医院手术切除的40 例结肠癌患者的癌及癌旁组织标本,以及结肠癌细胞系COLO320、RKO、CL-11 和正常肠黏膜细胞株NCM460,用qPCR 法检测结肠癌组织和细胞系中miR-143-3p 的表达水平。分别将miR-143-3p mimics、miR-143-3p inhibitor、EZH2 shRNA 及阴性对照质粒转染进RKO细胞,用CCK-8 法、Transwell 小室法分别检测miR-143-3p/EZH2 分子轴对RKO细胞增殖、迁移和侵袭的影响,用Western blotting 检测RKO细胞中EZH2蛋白的表达。用双荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p 和EZH2 的靶向关系。结果：miR-143-3p在结肠癌组织和细胞系中均低表达（均P<0.01）。过表达miR-143-3p 显著抑制RKO 细胞的增殖、迁移和侵袭能力（均P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实miR-143-3p 靶向EZH2。同时敲降miR-143-3p 和EZH2 可逆转敲降EZH2 对RKO细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。结论：miR-143-3p 通过靶向EZH2并下调其表达水平进而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭。     

Sphk1基因对间充质干细胞诱导结肠癌RKO细胞增殖和迁移的影响

目的： 探讨鞘氨醇激酶1 （sphigosine kinase 1, SphK1）基因下调对间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）诱导的 结肠癌RKO细胞增殖和迁移的影响。 方法： 采用MSC条件培养液（MSC-CM）和对照培养液（Control-CM）分别干预RKO细胞, CCK-8法检测细胞的增殖能力,Transwell实验检测细胞的迁移能力,Western blotting法检测Ki-67抗原（Ki-67）、MMP-2/9、肿瘤干 细胞标志物CD44和CD133蛋白的表达。用慢病毒shRNA载体转染RKO细胞抑制SphK1的表达,观察抑制SphK1的表达对 MSC-CM诱导的RKO细胞增殖、迁移以及MMP-2/9、CD44和CD133蛋白表达的影响。 结果： MSC-CM可时间依赖性促进RKO 细胞的增殖(P<0.05),并明显增强细胞的迁移能力(P<0.01)和细胞中Ki-67、MMP-2/9、CD44和CD133蛋白的表达(均P<0.05或P< 0.01)。慢病毒shRNA转染明显抑制RKO细胞SphK1的表达,抑制SphK1的表达可显著抑制MSC-CM对RKO细胞增殖和迁移的 促进作用(均P<0.05或P<0.01),且明显抑制MSC-CM诱导的Ki-67、MMP-2/9、CD44和CD133蛋白的表达。 结论： MSC-CM可 促进RKO细胞的增殖和迁移,下调SphK1可通过抑制MMP-2/9、CD44和CD133的表达逆转MSC-CM诱导的细胞增殖和迁移。     

MicroRNA-192对结肠癌RKO细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制研究

目的:探讨microRNA-192（miR-192）对于高侵袭性结肠癌RKO细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:将miR-192 mimics（miR-192）通过脂质体转染至RKO细胞,应用qRT-PCR检测细胞中miR-192表达情况,采用CCK-8实验和集落形成实验研究miR-192对结肠癌RKO细胞增殖的影响,采用细胞划痕实验和Transwell小室模型检测miR-192对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响,应用Western blot检测miR-192对结肠癌RKO细胞内上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin,E-cad）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达的影响。结果:CCK-8实验和集落形成实验结果显示:转染了miR-192的结肠癌RKO细胞,癌细胞增殖显著受到抑制。细胞划痕实验、迁移实验和细胞侵袭实验结果显示:RKO细胞转染miR-192后,迁移和侵袭的细胞数量显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示:结肠癌细胞转染miR-192后可升高E-cad蛋白的表达,并且降低VEGF蛋白的表达。结论:转染miR-192可抑制结肠癌RKO细胞增殖,降低其迁移和侵袭能力,其可能的机制是升高结肠癌RKO细胞E-cad的表达,并且降低VEGF的表达。miR-192可能作为肿瘤诊断及治疗的新靶点。     

Suppression of Cellular Apoptosis Susceptibility (CSE1L)Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis in ColorectalCancer Cells

The cellular apoptosis susceptibility (CSE1L) gene has been demonstrated to regulate multiple cellularmechanisms including the mitotic spindle check point as well as proliferation and apoptosis. However, theimportance of CSE1L in human colon cancer is largely unknown. In the present study, we examined expressionlevels of CSE1L mRNA by semiquantitative RT-PCR. A lentivirus-mediated small interfering RNA (siRNA)was used to knock down CSE1L expression in the human colon cancer cell line RKO. Changes in CSE1L targetgene expression were determined by RT-PCR. Cell proliferation was examined by a high content screeningassay. In vitro tumorigenesis was measured by colony-formation assay. Cell cycle distribution and apoptosiswere detected by flow cytometric analysis. We found CSE1L mRNA to be expressed in human colon cancer cells.Using a lentivirus based RNAi approach, CSE1L expression was significantly inhibited in RKO cells, causingcell cycle arrest in the G2/M and S phases and a delay in cell proliferation, as well as induction of apoptosisand an inhibition of colony growth capacity. Collectively, the results suggest that silencing of CSE1L may be apotential therapeutic approach for colon cancer.     

miR-147a通过抑制CCND1和CDK4的表达对膀胱癌细胞周期和增殖的影响

目的:探讨miR-147a在膀胱癌组织、细胞中的表达及对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响,研究miR-147a靶向负性调控CCND1和CDK4的表达对膀胱癌细胞周期和增殖的影响。方法:通过qRT-PCR检测miR-147a在正常膀胱组织和膀胱癌组织及正常膀胱上皮细胞、膀胱癌细胞系中的表达;使用miR-147a mimics转染观察细胞特性变化;CCK-8检测方法观察细胞增殖能力变化;流式细胞术观察细胞周期变化;生物信息学方法分析miR-147a的靶基因,并将靶基因进行GO分类和KEGG分析,找到与增殖和周期相关的基因;通过western blot方法验证miR-147a的靶基因,使用双萤光素酶报告基因系统检测miR-147a对CCND1和CDK4的转录活性影响;使用CCND1和CDK4特异性siRNA观察它们对细胞周期的影响,使用miR-147a inhibitor进行回补实验。结果:同正常组织/细胞相比,miR-147a在膀胱癌组织/膀胱癌细胞系中表达水平显著降低（P＜0.05）,miR-147a能够使膀胱癌细胞发生G1/S期阻滞,细胞增殖能力降低;通过一系列生信分析找到两个与细胞增殖和周期相关的miR-147a的靶基因CCND1和CDK4;通过间接和直接实验验证CCND1和CDK4是miR-147a的靶基因;下调CCND1和CDK4能够使膀胱癌细胞发生G1/S期阻滞,同时抑制miR-147a的表达能够解除G1/S期阻滞。结论:miR-147a作为一个抑癌因子,可作为诊断膀胱癌的生物标志物;miR-147a通过抑制CCND1和CDK4的表达抑制膀胱癌细胞周期G1/S期进程并抑制膀胱癌细胞增殖。     

沉默CDC6基因对结肠癌细胞增殖的影响及机制的初步研究

目的:探讨沉默CDC6表达对结肠癌细胞增殖的影响及可能作用的机制。方法:筛选高表达CDC6结肠癌细胞株,构建CDC6-shRNA慢病毒载体,感染结肠癌细胞,RT-qPCR、Western blotting验证。CCK8法、细胞克隆形成、流式细胞周期实验分别检测转染前后结肠癌细胞增殖及细胞周期变化。Western blotting检测各组ERK、pERK、AKT、pAKT蛋白水平。结果:CDC6在结肠癌SW620细胞中高表达,shRNA-CDC6慢病毒感染后,CDC6 mRNA及蛋白表达明显降低,敲减率达到82.2%（P＜0.01）。CDC6表达沉默后,CCK8实验结果显示,结肠癌细胞增殖速率明显下降,72小时抑制率达21.0%（P＜0.05）;细胞克隆实验也显示,干扰组结肠癌细胞克隆形成能力显著下降,相对对照组,干扰组细胞克隆数减少52.1%（P＜0.01）。流式细胞周期实验显示,相对对照组,干扰组细胞G0/G1期的细胞比例升高,从44.12%增加到55.03%（P＜0.05）。Western blotting实验结果显示,CDC6表达下调后,干扰组结肠癌细胞pERK、AKT及 pAKT蛋白表达显著减少（P＜0.05）。结论:沉默CDC6基因表达能抑制结肠癌细胞的增殖能力,可能与抑制ERK及AKT信号通路活性有关。     

miR-4728-3p通过PI3K/AKT信号通路调控DOT1L基因抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的:探讨miR-4728-3p通过调控类端粒沉默干扰体-1(disruptor of telomeric silencing 1-like,DOT1L)基因对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:使用乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231及人正常乳腺细胞MCF-10A。转染MCF-7和MDA-MB-231细胞随机分为NC组(转染miR-4728-3p-NC)和敲低组(转染miR-4728-3p-inhibitor)。利用RT-qPCR技术检测不同的细胞中miR-4728-3p和DOT1L的表达量改变情况。集落克隆形成实验和EDU实验可以同时检测体内各个细胞异常增殖的情况;TUNEL荧光标记检测法和流式细胞术实验可以同时检测不同组癌细胞的凋亡变化;划痕实验和Transwell实验可以同时检测到在各个细胞内因不同处理而可能产生的细胞迁移率和侵袭力的改变;Western blot检测与细胞凋亡状态相关细胞蛋白以及与细胞通路凋亡相关细胞蛋白p-AKT和p-PI3K相对表达的含量。结果:在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231以及SKBR3中发现miR-4728-3p和DOT1L的表达高于人正常乳腺细胞MCF-10A(P＜0.05)。转染细胞miR-4728-3p后,与NC组细胞进行实验比较,发现敲低组细胞中miR-4728-3p和DOT1L的表达量明显降低,且敲低组细胞的增殖能力明显减弱,细胞凋亡率明显升高,细胞迁移能力大大降低。敲低组的细胞凋亡活性蛋白相对表达明显发生变化。其中p-AKT与p-PI3K蛋白均被抑制激活。RT-qPCR和Western blot实验验证DOT1L是miR-4728-3p的下游靶向基因。结论:敲低miR-4728-3p可以下调DOT1L的表达从而促进乳腺癌细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞增殖,同时使乳腺癌细胞侵袭和迁移能力减弱。