敲低核蛋白1(NUPR1)基因抑制人U266多发性骨髓瘤细胞增殖并促进其凋亡北大核心CSCD

目的构建核蛋白1-短发夹RNA(NUPR1-sh RNA)慢病毒载体定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下调对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响。方法以正常浆细胞为对照,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测骨髓瘤U266细胞和RPMI8226细胞的NUPR1 m RNA水平。设计针对NUPR1基因的sh RNA并包装慢病毒载体感染U266细胞,流式细胞术观察转染效率,q RT-PCR、Western blot法验证NUPR1基因干扰效果,CCK-8法及台盼(trypan)蓝染色检测细胞增殖,流式细胞术及Hoechst染色观察细胞凋亡。结果与正常人浆细胞相比,U266、RPMI8226细胞NUPR1 m RNA水平较高;U266细胞慢病毒感染效率达80%,NUPR1-sh RNA慢病毒载体构建成功。敲低NUPR1水平后,U266细胞增殖减弱,抑制率高达(58.71±1.64)%;与阴性对照组和空白对照组相比,敲低NUPR1水平后,U266细胞凋亡率明显增加。结论敲低U266细胞NUPR1水平后,可明显抑制U266细胞增殖并促进其凋亡。     

PLK1与P53在食管鳞癌细胞中的表达及相关性研究

目的:探讨质粒表达载体介导的RNA干扰抑制PLK1 基因表达对人食管鳞癌细胞Eca-109的P53基因的影响.方法:构建靶向人PLK1基因的RNA干扰表达质粒(PLK1-shRNA),将该干扰质粒转染到人食管鳞癌细胞Eca-109中,采用Western blot技术分析检测RNA干扰后48 h、72 h各组细胞PLK1基因和P53基因蛋白表达水平的变化.结果:Western blot结果显示,转染RNA干扰表达质粒(PLK1-shRNA)后,PLK1-shRNA组Eca-109细胞48 h、72 h较转染液对照组的PLK1基因蛋白表达分别降低了83.7%和56.0%(P<0.05);PLK1-shRNA组Eca-109细胞48 h、72 h较转染液对照组的P53基因蛋白表达分别升高了46.0%和70.5%(P<0.05).结论:RNA干扰PLK1基因能够有效地抑制Eca-109细胞中PLK1基因的表达,从而有效地升高P53基因的表达,说明PLK1基因抑制P53基因在Eca-109细胞中的表达.     

慢病毒载体抑制FOXM1对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响与分子机制

目的:研究靶向转录因子FOXM1 shRNA慢病毒载体抑制FOXM1表达对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及其分子机制。方法:应用感染复数(MOI)为20的靶向FOXM1shRNA慢病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞,MTT比色法检测感染后SKOV3细胞的生长曲线;流式细胞术分析感染72 h后细胞周期变化;实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测感染72 h后FOXM1、Cyclin D1、PLK1等基因mRNA及蛋白表达变化。结果:MOI为20的靶向FOXM1 shRNA慢病毒颗粒能显著抑制SKOV3细胞生长,并将细胞阻滞在G0/G1期而S期细胞减少(P<0.01);显著下调FOXM1、CyclinD1、PLK1等基因mRNA及蛋白表达。结论:抑制FOXM1表达对人卵巢癌SKOV3细胞具有显著的增殖抑制作用。其作用与下调Cyclin D1、PLK1等蛋白的表达将细胞阻滞在G0/G1期有关。     

NSPc1是维持HeLa细胞正常增殖的必要因子

目的 研究多梳蛋白家族成员NSPc1对HeLa细胞增殖的影响。方法 运用生物信息学设计并合成敲低NSPc1表达的siRNA序列,用半定量RT-PCR、Real-time PCR及Western blot等检测siRNA序列在HeLa细胞中敲低NSPc1的有效性;将相应有效序列构建到pSUPER载体中,观察其瞬时转染对HeLa细胞BrdU掺入的影响;用G418筛选并建立稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,观察敲低NSPc1对HeLa细胞体外增殖能力的影响。结果 （1）设计的siRNA序列可显著敲低NSPc1的表达;（2）瞬时敲低NSPc1阻碍了HeLa细胞BrdU的掺入;（3）成功构建稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,其增殖速度较对照组明显变慢;结论 NSPc1的正常表达是维持HeLa细胞正常增殖能力所必需的,稳定敲低NSPc1的HeLa细胞群可作为进一步研究NSPc1相关信号通路的有效模型。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

敲低Stau1后小鼠前脂肪细胞系3T3-L1中FOXP1的表达增加

目的 在小鼠前脂肪细胞系3T3-L1分化过程中敲低双链RNA结合蛋白Staufen1(Stau1)后筛选差异表达的基因，分析其生物学功能，并用qPCR验证测序结果。方法 用RNA-seq分析Stau1敲低后基因的转录调控。构建STAU1 shRNA并转染3T3-L1细胞，鸡尾酒方法诱导其分化为成熟脂肪细胞，收取0、4 d的细胞设立对照组和STAU1敲低组(各3组生物重复样本)收取12组样品的细胞基因芯片信息，以变化倍数log2(Fold change)>1且校正后的P<0.05作为条件筛选Stau1敲低的细胞与对照组样本间的差异表达基因，进行基因本体论(GO)及代谢通路分析(KEGG通路数据库),qPCR验证差异表达的基因。荧光素酶报告基因实验验证SATU1与叉头盒蛋白P1 FOXP1 mRNA 3′UTR上Staufen1结合位点(SBS)存在结合。结果 较对照组STAU1敲低细胞组中共筛选出差异表达基因588个，其中上调406个、下调182个。差异表达基因主要参与的生物学过程中脂代谢、炎性反应因子，主要富集的信号通路有糖代谢和能量代谢相关通路。敲低Stau1后FOXP1...     

抑制Polo样激酶1表达靶向DNA错配修复相关通路并抑制卵巢癌的相关研究

目的:观察Polo样激酶1(PLK1)在卵巢癌(OC)细胞和组织中的表达情况,以及抑制PLK1表达对耐5-氟尿嘧啶(5-FU)的OC细胞活力和凋亡的影响。方法:在2011年4月～2018年12月的126名OC患者纳入本研究。采用免疫组化法检测PLK1在OC组织及邻近正常卵巢组织中的表达水平。体外构建耐5-FU的OC细胞系(OVCAR3-5FU_(res)和SKOV3-FU_(res))。将PLK1重组质粒和PLK1-sh RNA慢病毒载体(sh-PLK1)分别转染到OVCAR3、SKOV3、OVCAR3-5FU_(res)和SKOV3-5FU_(res)细胞中。采用CCK-8法检测细胞活力;通过串联亲和纯化和质谱分析确定PLK1在OC细胞中的结合蛋白;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:在OC细胞系中,PLK1水平显著上调(P0.05);并且在大多数OC组织中,PLK1表达较癌旁组织显著上调(P0.05)。Kaplan-Meier分析显示,PLK1高表达OC患者的平均存活时间显著短于PLK1低表达OC患者(P0.001)。OC中PLK1水平的升高与FIGO分期、肿瘤分级和错配修复缺陷等临床病理特征显著相关(P0.05)。与阴性对照细胞相比,转染sh-PLK1的细胞活力显著降低(P0.05);而转染PLK1重组质粒的OVCAR3和SKOV3细胞的活力显著高于对照细胞。通过串联亲和纯化和质谱分析确定人Mut S蛋白同系物2(hMSH2)是PLK1在OC细胞中的结合蛋白,并且h MSH2基因敲除使sh-PLK1转染的OVCAR3-5FU_(res)细胞的凋亡率降低(P0.01)。结论:抑制PLK1表达通过靶向h MSH2提高了OC细胞对5-FU的敏感性。     

Hsa-miR-218靶向调控LASP1对宫颈癌HeLa细胞生长的影响

目的:探讨人微小RNA-218(Homo sapiens microRNA-218,hsa-miR-218)对宫颈癌HeLa细胞生长的影响及分子机制。方法:构建hsa-miR-218的重组慢病毒表达载体pmiR-218,并将pmiR-218感染至HeLa细胞,台盼蓝拒染法检测细胞数量的变化,WST-8法检测细胞活力,构建萤光素酶报告基因载体验证miR-218与LIM和SH3蛋白1(LASP1)的相互结合作用,real-time PCR检测LASP1的mRNA相对表达水平,Western blot检测LASP1蛋白的表达水平。结果:经DNA测序证实与设计完全一致,测序结果显示成功构建了重组慢病毒表达载体pmiR-218。pmiR-218转染HeLa细胞72 h后HeLa细胞存活数量为176±9,对HeLa细胞活力的抑制率具有时间效应关系,较空白对照组比较,差异显著(P0.05);萤光素酶活性结果显示,克隆LASP1-3’UTR的质粒与miR-218 mimics共转染293T细胞,引起萤光素酶活性的减低;real-time PCR结果显示转染pmiR-218后,miR-218表达水平增加;过表达miR-128能下调LASP1 mRNA及蛋白的相对表达水平,与空白对照组及阴性对照组比较,差异显著(P0.01)。结论:pmiR-218有效抑制HeLa细胞的生长,并具有时间-效应关系,其机制可能是miR-218通过靶向结合LASP1的3’UTR,从而下调其在HeLa细胞的表达有关。     

PLK1靶向β-catenin介导慢性肾脏病炎症状态下足细胞转分化

目的探讨慢性肾脏病微炎症状态下PLK1(polo-like kinase 1)在足细胞上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用机制。方法以条件永生化小鼠足细胞系为研究对象进行分组:正常对照组;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导组;PLK1 shRNA组(PLK1 shRNA+LPS)及Scramble shRNA组(Scramble shRNA+LPS)。利用Real-time PCR、Western blot检测足细胞中PLK1、结蛋白(desmin)mRNA及蛋白表达水平;Western blot检测PLK1对β-链蛋白(β-catenin)的作用;Western blot检测EMT相关分子E-钙粘素(E-cadherin)及波形蛋白(vimentin)的表达;Western blot检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的水平;Transwell迁移实验检测足细胞迁移能力。结果 LPS诱导炎症状态下,足细胞PLK1 m RNA及蛋白表达升高伴随β-catenin上调,同时,GSK-3β表达降低,vimentin呈现高表达,而E-cadherin呈现低表达;PLK1 shRNA转染足细胞可特异性敲低PLK1表达,下调β-catenin,伴随GSK-3β表达增加,逆转足细胞EMT的发生;且炎症状态下,足细胞Desmin表达增加;Transwell显示足细胞迁移能力增强。结论 LPS刺激可导致足细胞PLK1高表达,其可能通过负向调控β-catenin降解复合物(axin/GSK-3/APC)从而稳定β-catenin的表达,继而下调Vimentin,导致足细胞损伤及EMT的发生。     

敲低转移黏附蛋白(MTDH)基因抑制SGC7901细胞增殖及迁移北大核心CSCD

目的通过小干扰RNA技术(RNAi)敲低胃癌SGC7901细胞转移黏附蛋白(MTDH)即星形细胞上调基因1(AEG-1),并探讨其对SGC7901细胞增殖和迁移的影响。方法构建MDTH短发夹RNA(MTDH-sh RNA)质粒并转染SGC7901细胞,Western blot法检测SGC7901细胞MTDH蛋白水平。敲低SGC7901细胞MTDH水平后,MTT法检测细胞增殖情况,TranswellTM小室检测SGC7901细胞迁移能力。结果 MTDH-sh RNA转染SGC-7901胃癌细胞后,可明显敲低细胞中MTDH蛋白水平。敲低SGC7901细胞MTDH水平后,细胞的增殖和迁移能力均显著降低。结论敲低SGC7901细胞MTDH水平可抑制SGC-7901胃癌细胞的增殖和迁移。     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

长链非编码RNA EPB41L4A-AS1通过AKT调控子宫颈癌细胞的自噬水平

目的 探讨长链非编码RNA EPB41L4A-AS1通过AKT调控子宫颈癌细胞自噬的作用和机制。方法 运用小干扰RNA(siRNA)敲低子宫颈癌细胞HeLa中的EPB41L4A-AS1后,应用Western blot技术检测p62、LC3和AKT的蛋白表达水平,qRT-PCR检测AKT1和AKT2的mRNA表达水平。在GFP-LC3稳定过表达的HeLa细胞中转染siEPB41L4A-AS1,利用共聚焦扫描显微镜检测外源性LC3形成的自噬小体的变化。在HeLa细胞中转染siEPB41L4A-AS1,利用免疫荧光技术和荧光显微镜检测内源性LC3形成的自噬小体的变化。基因集富集(gene set enrichment analysis, GSEA)分析AKT和自噬通路在EPB41L4A-AS1高表达组和低表达组子宫颈癌患者中的富集情况。结果 与对照组相比,敲低EPB41L4A-AS1 48 h后HeLa细胞中p62表达水平显著下降(10%血清组：1.00±0 vs 0.39±0.17,无血清组：1.00±0 vs 0.55±0.14,P<0.05);LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值显著上升(...     

敲低 Aurora-A 抑制 HepG2人肝癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨敲低Aurora-A对HepG2人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计Aurora-A短发夹RNA(shRNA)片段,构建和包装Aurora-A shRNA慢病毒载体,转染HepG2细胞,实时定量PCR检测Aurora-A mRNA表达,Westernblot法检测Aurora-A蛋白及磷酸化水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建Aurora-A shRNA慢病毒载体,转染后的HepG2细胞Aurora-A蛋白磷酸化水平明显降低。敲低Aurora-A后,HepG2细胞增殖显著降低,细胞凋亡率显著增加。结论敲低Aurora-A的表达抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡。     

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对肾小管上皮HK-2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制

目的观察中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在HK-2肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用以及对自噬的调控作用。方法设计并合成3组NGAL基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列并转入HK-2细胞,实时定量PCR检测HK-2细胞中NGAL mRNA水平、Western blot法检测NGAL蛋白水平,筛选抑制效率最佳的一组用于后续实验。对NGAL敲减的HK-2细胞进行缺氧/复氧处理,检测微管相关蛋白1轻链3(LC-3)Ⅱ和beclin-1表达水平,并用Cell Titer-Blue细胞活性检测系统和CCK-8法检测细胞活力。结果成功构建3组NGAL基因沉默shRNA质粒,转染HK-2细胞后NGAL mRNA和蛋白水平表达均低于空白载体对照;缺氧/复氧处理后,NGAL敲减的HK-2细胞LC-3Ⅱ和beclin-1表达水平低于空白载体对照,而外加400 ng/m L NGAL的HK-2细胞LC-3Ⅱ及beclin-1水平高于缺氧/复氧对照;用Cell Titer-Blue和CCK-8法检测NGAL敲减组的细胞活力均低于空白载体对照组。结论 NGAL在HK-2肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤起一定保护作用,可能与增强自噬相关。     

PABPC1对人单核白血病细胞系THP-1翻译活性的影响

目的 研究细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-1(PABPC1)对人单核细胞白血病细胞系THP-1翻译活性的影响。方法 在THP-1细胞中转染shPABPC1,Western blot验证敲低效率，多聚核糖体分析技术检测细胞翻译活性变化。结果 转染后THP-1细胞中PABPC1表达被抑制(P<0.001);与对照组相比，敲低PABPC1组的翻译活性减弱。结论 敲低PABPC1可抑制THP-1细胞翻译活性，PABPC1可能成为治疗急性髓系白血病(AML)的潜在靶点。     

敲低肝癌细胞STAT3抑制IFN1诱导的HepG2肝癌细胞增殖和迁移

目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测STAT3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低STAT3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关STAT1信号的磷酸化水平。结果筛选对STAT3敲低效果最显著的STAT3 shRNA1和STAT3 shRNA2,敲低STAT3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低STAT3水平后,肝癌细胞STAT1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后STAT1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞STAT3通过上调STAT1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。     

MiR-100对肝癌细胞有丝分裂阻滞及Polo样激酶1蛋白表达的作用

目的 探讨microRNA-100（miR-100）对肝癌细胞有丝分裂阻滞及Polo样激酶1 （PLK1) 表达的作用。方法 采用实时定量PCR和免疫荧光方法检测miR-100和PLK1在人肝癌细胞HepG2中的表达。利用Oligofectamine脂质体介导将Cy3荧光标记的miR-100模拟物瞬时转染HepG2细胞,分析细胞有丝分裂和PLK1蛋白表达情况。结果 肝癌细胞HepG2的miR-100表达量低于正常肝细胞,而PLK1 mRNA和蛋白表达却异常升高。在miR-100模拟物转染后48h,实验组细胞有丝分裂指数显著小于对照细胞,经Western blotting分析显示,实验组细胞PLK1蛋白表达水平较对照组细胞均显著减低。同时免疫细胞化学检测发现,在有丝分裂中晚期和末期位于细胞核内的PLK1蛋白基本消失。结论 miR-100具有抑制PLK1蛋白表达的作用,可引起肝癌细胞有丝分裂阻滞。     

RNAi沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨利用RNA干扰沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2细胞生长,凋亡的影响,为肝癌的基因治疗提供理论依据。方法:利用脂质体将siRNA真核表达载体转入HepG2细胞中,并检测转染效率;利用免疫细胞化学染色方法检测HepG2细胞中WT1蛋白水平的表达,测定基因沉默效果;用MTT法测定HepG2细胞生长曲线;电镜下观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测凋亡率。结果:利用脂质体为载体将siRNA真核表达载体转染HepG2细胞,转染率达70%以上,转染后细胞中WT1蛋白表达水平下降;RNA干扰沉默WT1基因可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论:靶向WT1的序列特异性siRNA可显著抑制WT1基因的表达;下调HepG2细胞WT1基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

HPV18 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的探讨HPV18 E6siRNA联合紫杉醇应用对宫颈癌细胞生长的影响。方法用RNAi抑制HeLa细胞中HPV18 E6蛋白的表达。Western blot检测E6、P53和P21的蛋白表达量,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对紫杉醇的敏感性。结果抑制HPV18 E6的表达后,P53和P21的表达量均显著升高,HeLa细胞的生长受到抑制(P<0.01)。加入紫杉醇后,细胞增殖速度较对照组明显降低(P<0.01)。结论HPV18 E6siRNA可有效沉默HeLa细胞中E6基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对化疗药物的敏感性。     

Ku70对HTLV-1阳性T细胞中HTLV-1病毒蛋白表达的影响

目的:探讨Ku70对人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)阳性T细胞中HTLV-1病毒蛋白表达的影响。方法:Western blot实验检测不同的HTLV-1阳性T细胞系中Ku70的表达水平;构建Ku70基因沉默siRNA并通过Western blot实验检测其敲减Ku70表达的效率;采用siRNA在HTLV-1阳性的T细胞中敲减Ku70表达后,通过real-time PCR和Western blot实验分别检测HTLV-1病毒蛋白在mRNA和蛋白水平上的表达量,并通过real-time PCR实验检测干扰素和促炎因子的表达量。结果:HTLV-1阳性T细胞系MT2、MT4及C8166中的Ku70均呈高表达;采用siRNA敲减Ku70的表达后,MT2细胞及MT4细胞中的HTLV-1病毒蛋白表达量上升;采用siRNA敲减Ku70的表达后,MT2细胞及MT4细胞中干扰素α、干扰素γ及肿瘤坏死因子α的表达下降。结论:Ku70在HTLV-1阳性T细胞中高表达;在HTLV-1阳性T细胞中,Ku70促进干扰素和促炎因子的表达,抑制HTLV-1病毒蛋白的表达。