雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞自噬的影响

目的：探讨雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）自噬的影响。方法：将自噬双标mRFP-eGFP-LC3质粒转染进ARPE-19细胞中获得稳定表达的转染细胞株,随后随机分为6 h对照组、6h模型组、6 h雷帕霉素组;12 h对照组、12 h模型组、12 h雷帕霉素组和24 h对照组、24 h模型组、24 h雷帕霉素组。对照组避光培养,模型组受光照刺激;雷帕霉素组加入10μmol/L雷帕霉素后受光照刺激,光源采用LED冷光灯,在（16 500±500） lx光照强度下照射细胞6、12、24 h。检测转染效率,MTT检测ARPE-19细胞存活率;激光共聚焦显微镜对自噬流变化进行定性分析,透射电镜观察细胞自噬形态;蛋白免疫印迹法对Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白表达量进行检测。结果：与对照组相比,模型组光照6、12、24 h后,细胞存活率显著下降（P<0.001）;雷帕霉素组经光照后细胞存活率高于模型组（P<0.05）。光照6、12、24 h后模型组红色荧光斑点较对照组逐渐增多,绿色荧光斑点也随之增加,Merge图中从光照12 h开始黄色斑点数量增多明显。...     

葡萄糖浓度对乳鼠心肌细胞自噬的影响

目的观察葡萄糖浓度对乳鼠心肌细胞自噬的影响。方法建立体外培养乳鼠心肌细胞模型,随机分成对照组（5．5mmol／L）,高糖组（25mmol／L）,对照＋雷帕霉素组（100nmol／L）,高糖＋雷帕霉素组（100nmol／L）。分别测定各组心肌细胞面积;用RT-PCR检测心肌肥大标记基因[心房利钠肽（ANP）、β-肌球蛋白重链（13-MHC）]表达情况;运用Western印迹检测自噬标记性蛋白微管相关蛋白3（LC-3）的表达。结果（1）高糖组心肌细胞肥大相关指标较对照组升高,高糖组LC-3的表达较对照组减低,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）高糖＋雷帕霉素组心肌细胞肥大相关指标较对照＋雷帕霉素组升高,高糖＋雷帕霉素组LC-3较对照＋雷帕霉素组减低,但差异均无统计学意义。（3）高糖＋雷帕霉素组心肌细胞肥大相关指标较高糖组减低,高糖＋雷帕霉素组LC-3表达较高糖组升高,差异均有统计学意义。结论（1）培养基中葡萄糖浓度升高可导致心肌细胞肥大,同时合并有心肌细胞自噬水平的下降。（2）在高糖培养基中加入雷帕霉素可升高心肌细胞的自噬水平,同时抑制高糖导致心肌细胞肥大效果。（3）培养基中葡萄糖浓度升高导致心肌细胞肥大的效果可能与心肌细胞自噬水平的改变相关。（4）结合本实验的研究结果,自噬在糖尿病性心肌病方面可能起一定作用。     

雷帕霉素诱导Ana-1细胞自噬杀伤黑素化马尔尼菲青霉

目的 探究巨噬细胞吞噬黑素化马尔尼菲青霉(PM)后的自噬水平变化,并探究雷帕霉素通过诱导巨噬细胞自噬杀灭该菌的可行性.方法 采用含多巴培养基培养获得酵母相黑素化PM,蛋白质印记法检测黑素化及常规PM刺激后Ana-1细胞Ⅱ型微管相关蛋白1轻链3(LC3 Ⅱ)的表达水平,并检测雷帕霉素预处理后Ana-1细胞LC3 Ⅱ的表达水平,继而采用免疫荧光法显示LC3 Ⅱ与黑素化PM在细胞内的定位;通过菌培养测算雷帕霉素的直接抗菌作用,并检测有无雷帕霉素预处理的Ana-1细胞对黑素化PM的杀菌效能.结果 Ana-1细胞吞噬黑素化PM后自噬水平无明显变化(P＞0.05),而雷帕霉素处理后染菌的Ana-1细胞LC3 Ⅱ表达水平明显升高(P=0.009,P＜0.05),并且菌体与LC3蛋白呈共定位关系.雷帕霉素处理后Ana-1细胞与黑素化PM共孵育3h(P=0.026)和6h(P=0.014)后菌存活率明显降低(P＜0.05),而相同条件下单纯的Ana-1细胞或雷帕霉素无明显杀菌作用.结论 黑素化PM抑制巨噬细胞的自噬活化,雷帕霉素可通过诱导自噬提高巨噬细胞对该菌的杀菌效能.     

疏风活血方通过自噬途径对体外培养的鼠B16黑素瘤细胞黑素代谢起调节作用

目的观察自噬在疏风活血方对体外培养的鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成中的作用。方法体外培养鼠B16细胞,设 立空白对照组（C组）,0.12、0.25、0.49、0.98、1.96 mg/mL疏风活血方组（S组）,自噬诱导剂雷帕霉素组（R组）,自噬诱导+疏风活 血方组（RS组）,采用MTT法测定各组对B16细胞增殖的影响,酶标仪检测法测定各组酪氨酸酶活性及黑素含量,Western blot 法测定自噬相关蛋白P62、p-mTOR、LC3B、Beclin1含量,比较分析结果。结果与C组相比,S组及RS组对B16细胞增殖均起浓 度依赖的抑制作用（P<0.05）;对酪氨酸酶活性及黑素合成有促进作用（P<0.05）;0.98 mg/mL疏风活血方组（R0.98）、自噬诱导+ 0.98 mg/mL疏风活血方组（RS0.98）、50 nmol/L自噬诱导剂雷帕霉素组（Rap50）均能上调自噬相关蛋白LC3B-II、Beclin1,下调 P62、p-mTOR含量。结论疏风活血方能通过激活自噬途径对体外培养的鼠B16黑素瘤细胞黑素代谢起调节作用,对其细胞增 殖有抑制作用;对酪氨酸酶活性及黑素合成起促进作用。     

mTOR磷酸化水平对成骨MC3T3E1细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制

通过雷帕霉素（RAPA）和MHY1485抑制和激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化,探讨磷酸化mTOR（p-mTOR）水平变化对成骨细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制。     

雷帕霉素诱导人黑素瘤细胞M14自噬及Bcl-2?Bax表达的变化

目的:对雷帕霉素诱导黑素瘤细胞发生自噬的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制?方法:不同浓度雷帕霉素(10?50?100 nmol/L)处理黑素瘤细胞M14,采用MDC荧光染色检测自噬囊泡;免疫细胞化学法检测自噬蛋白LC3B的表达;透射电子显微镜观察黑素瘤细胞超微结构的变化;Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达;采用罗丹明123染色(Rhodamine 123)流式细胞术检测线粒体膜电位的变化;MTT比色法检测雷帕霉素对M14细胞增殖的抑制作用?结果:经不同浓度的雷帕霉素处理后,MDC阳性细胞数增多,M14细胞发生自噬;自噬蛋白LC3B的表达增强;自噬水平随雷帕霉素浓度的升高而逐渐增强?透射电子显微镜观察可见M14细胞质内有大量独立双层膜结构?线粒体肿胀并出现自噬体?自噬溶酶体?Western blot结果显示雷帕霉素可以下调M14细胞中的凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,同时上调凋亡诱导蛋白Bax的表达?雷帕霉素可引起M14细胞的线粒体膜电位下降,与对照组相比差异显著(P < 0.05)?10~100 nmol/L的雷帕霉素明显抑制黑素瘤细胞M14的增殖,该作用呈剂量依赖性,随着药物浓度的升高,抑制率增加,与空白对照组比较均有显著性差异(P < 0.01)?结论:10~100 nmol/L的雷帕霉素可诱导黑素瘤细胞发生自噬,抑制细胞的生长?其机制可能与蛋白Bcl-2和Bax表达水平有关?     

Fascin-1介导自噬参与子宫内膜细胞的生物学行为改变

目的：探讨自噬在子宫内膜异位症中的作用机制,为通过靶向干预自噬防治子宫内膜异位症提供理论基 础。方法：使用ATG5干扰片段、自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)和自噬抑制剂3-MA等干预子宫内膜CRL-7566细胞自 噬,通过克隆形成、细胞生长曲线和MTT检测其对细胞的生长增殖和侵袭力的影响。收集20例子宫内膜异位症患者 临床标本,检测自噬标志物LC3II和自噬底物蛋白P62的表达。结果：雷帕霉素抑制子宫内膜CRL-7566细胞的增殖和 克隆形成,而自噬抑制剂3-MA及自噬相关基因ATG5的干扰作用相反。雷帕霉素抑制子宫内膜细胞的伪足生长,而伪 足相关蛋白fascin-1的过表达能抑制雷帕霉素引起的侵袭力下降。与对照组相比,在子宫内膜异位症患者的临床标本 中,自噬标志物LC3II显著降低而自噬底物P62增加。结论：自噬抑制可能促进子宫内膜细胞的增殖和侵袭,自噬激 活可能是子宫内膜异位症治疗的潜在靶点。     

裸鼹鼠与C57BL/6小鼠自噬调节的比较研究

目的 比较裸鼹鼠与小鼠的自噬调节,以期为裸鼹鼠高自噬、抗癌、衰老缓慢等生物学特性的研究提供参考.方法 利用电镜技术和蛋白印迹检测新生裸鼹鼠和C57BL/6小鼠肝脏和肺脏组织的自噬水平.自噬干扰裸鼹鼠成纤维细胞和小鼠成纤维细胞,24、48、72h CCK-8细胞计数法检测细胞的增殖情况,蛋白印迹检测各组细胞各个时间点Beclin 1的表达水平.结果 与C57BL/6小鼠比较,裸鼹鼠组织的LC3B表达显著较高.裸鼹鼠细胞对自噬抑制剂3-MA具有一定的耐药性,自噬诱导剂雷帕霉素对裸鼹鼠细胞的增殖抑制显著高于小鼠细胞.结论 裸鼹鼠组织具有高自噬水平,应对外界的自噬抑制压力时,裸鼹鼠细胞的自身调节能力明显高于C57BL/6小鼠.     

胶质瘤干祖细胞分化与自噬的相关性研究

目的 观察胶质瘤干祖细胞(GSPCs)诱导分化前后自噬活性的变化,探讨GSPCs分化与自噬的相关性.方法 于干细胞培养基和诱导分化培养基培养GSPCs,分别采用微管相关蛋白轻链3(LC3)免疫荧光染色、透射电镜及Western blot检测GSPCs分化前后自噬活性的变化.GSPCs诱导分化时,加入3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂,观察其对GSPCs分化的影响,并采用自噬激活剂雷帕霉素(RPM)行进一步检测.结果 GSPCs分化前,自噬活性低;诱导其分化后,自噬活性增高.加入自噬抑制剂3-MA可抑制GSPCs贴壁分化;Western blot检测示,加入3-MA的GSPCs中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白-2(MAP-2)及beclin-1表达量显著低于未加3-MA的GSPCs.GSPCs在含血清条件下培养时,适当浓度的RPM可促进其贴壁分化.结论 GSPCs分化与其自噬活性密切相关.增强GSPCs自噬活性可促进分化,抑制其自噬活性可抑制分化.     

雷帕霉素诱导急性T淋巴白血病细胞自噬分子机制的研究

目的：研究不同浓度雷帕霉素对急性白血病CD4+T-Jurkat细胞增殖的影响，并从自噬方面探讨其作用机制。方法：MTT法检测不同浓度雷帕霉素对细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞凋亡率和周期阻滞；吖啶橙染色观察自噬溶酶体的变化；转录组测序数据分析自噬相关基因的差异表达；RT-qPCR和Western Blot实验检测自噬相关基因的转录和蛋白质表达水平；FAIRE-qPCR分析自噬基因启动子区的染色质可及性状态。结果：与对照组相比，雷帕霉素呈浓度和时间依赖性方式抑制Jurkat细胞的增殖；并将细胞周期阻滞在G0/G1期，但不能有效诱导细胞凋亡。通过吖啶橙染色观察，给药后可见自噬溶酶体的数量增加。RNA-seq数据显示，雷帕霉素可以显著影响自噬相关基因的转录水平。不同浓度雷帕霉素作用于Jurkat细胞48 h后，10 nmol/L和20 nmol/L浓度的雷帕霉素可上调ULK1、ATG13、ATG16L2、PI3K3R1、Raptor基因的表达，下调MAPK1基因的表达；50 nmol/L时，下调各基因的表达水平。自噬基因启动子区域染色质可及性也随之发生改变，与基因表达变化趋势基本一致。结论...