rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的细胞活性研究

目的：检测不同浓度的rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的生物学活性。方法：通过细胞计数（MTT法）,碱性磷酸酶（ALP）活性检测,对不同浓度的rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的活性进行检测。结果：不同浓度的rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料对体外培养的Beagle犬骨髓基质细胞（MSC）的增殖和碱性磷酸酶的含量的影响不同。结论：rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的生物学活性有剂量依赖性,和细胞浓度也有关。     

rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的活性研究

目的:检测不同浓度的rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的生物学活性.方法:通过细胞计数(MTT法),碱性磷酸酶(ALP)活性检测,对不同浓度的rhBMP-2/bTGF-β1/胶原复合材料的活性进行检测.结果:不同浓度的rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料对体外培养的Beagle犬骨髓基质细胞(MSC)的增殖和碱性磷酸酶的含量的影响不同.结论:rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的生物学活性有剂量依赖性.     

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目的    检测rhBMP-2/hTGF-β1 /胶原复合材料与rhBMP-2/hTGF-β1生物学活性的差别。方法        本研究于2010年5—12月在福建医科大学附属口腔医院实验室进行。分离培养的Beagle犬骨髓基质细胞中加入质量浓度相同的rhBMP-2/hTGF-β1或rhBMP-2/hTGF-β1 /胶原复合材料后继续培养4 d,通过细胞计数（MTT法）、碱性磷酸酶（ALP）活性检测,分别对rhBMP-2/hTGF-β1 /胶原复合材料和rhBMP-2/hTGF-β1的生物学活性进行检测,并比较其活性差别。结果    rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料和rhBMP-2/hTGF-β1均具有生物学活性,并且其生物学活性差异无统计学意义（P > 0.05）。结论    这种合成rhBMP-2/hTGF-β1 /胶原复合材料的方法不会改变生长因子的生物学活性。     

水凝胶与陶瓷化骨及β-磷酸三钙复合对骨髓基质细胞成骨能力的影响

目的：观察水凝胶（hydrogel，HG）分别与陶瓷化骨（ceramic bovine bone，CBB）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）复合成的复合材料对骨髓基质细胞（MSCs）的生长、分化的影响，寻找更适合骨组织工程的复合物支架材料。方法：将诱导的骨髓基质细胞接种于CBB/HG、β-TCP/HG上，另外MSCs分别接种于单纯的CBB、β-TCP上作为对照，进行体外培养。5、10d取材，细胞计数观察贴附及增殖情况，扫描电镜观察细胞形态以及材料的贴附情况，检测碱性磷酸酶的活性以及免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原的分泌情况。结果：骨髓基质细胞与各组材料均能形态良好贴附，两种复合材料上贴附的细胞数量明显高于对照组，CBB/HG、β-TCP/HG两组间细胞的碱性磷酸酶的活性以及Ⅰ型胶原的分泌量无明显差别，但显著高于对照组。结论：CBB/HG、β-TCP/HG均能促进骨髓基质细胞分化及基质分泌，是一良好的组织工程骨构建复合材料。     

转染人骨形成蛋白-7基因对骨髓基质细胞体外生物学活性的影响

目的：观察hBMP-7基因转染对Beagle犬骨髓基质细胞（BMSC）生物学特性的影响。方法：利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC，观察细胞形态及生长情况，检测碱性磷酸酶、骨钙素及钙化结节等成骨细胞表型。结果：目的基因转染后细胞形态略有变化，增殖能力无明显改变，凋亡率无明显变化，碱性磷酸酶活性明显增高，骨钙素表达增强，钙化结节增大。结论：hBMP-7基因转染可以加速BMSC向成骨细胞表型转化。hBMP-7基因转染的BMSC有望成为牙周组织工程理想的种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞培养及鉴定

目的：对新西兰大白兔骨髓基质干细胞（BMSCs）进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点，获得足够量的细胞用于材料细胞相容性实验。方法：骨髓髓腔冲洗获得新西兰大白兔幼兔股骨骨髓，用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs，胰酶消化传代，用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况，对传代细胞进行HE染色和碱性磷酸酶（ALP）染色。结果：幼兔骨髓基质干细胞体外培养生长良好，原代细胞约2周汇成单层，传代后1周左右长满瓶底。HE染色光镜下观察见兔骨髓基质干细胞为单核细胞，细胞呈梭形或不规则长多边形，传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论：兔骨髓基质干细胞的体外增殖能力强，可诱导为成骨细胞，可作为骨缺损材料细胞相容性研究的受试细胞。并且可以作为骨组织工程的种子细胞。     

rhBMP-2及rhbFGF对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响

目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独、联合及序贯作用对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶作用的长期效应。方法:在细胞培养技术下,采用碱性磷酸酶检测试剂盒检测单独、联合及序贯施加rhBMP-2和rhbFGF后,兔骨髓间充质干细胞在第2、5、7及10天时碱性磷酸酶的活性水平,以反映对细胞分化作用的影响,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2能长期显著地促进细胞的碱性磷酸酶活性,而rhbFGF则起到抑制作用,且均呈剂量依赖性。rhBMP-2单独作用与2种生长因子联合作用的效应相近,且均高于rhbFGF单独作用或2种因子序贯作用的效应。结论:不同生长因子的不同应用方式.对骨髓间充质干细胞分化作用的长期效应不同。     

骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓基质细胞的生物学作用

目的：探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(b—FGF)单独或联合作用对人骨髓基质细胞(HBMSC)增殖和分化的影响。方法：利用四唑盐比色法(MTT)、碱性磷酸酶(ALP)测定法观察不同浓度的rhBMP-2和b—FGF单独或联合作用时HBMSC的增殖和分化情况。结果：rhBMP-2对HBMSC的增殖和ALP表达均有促进作用；b—FGF促进HBMSC增殖，但抑制ALP表达；rhBMP-2和b—FGF联合作用时HBMSC的增殖和ALP活性较单独作用有显著提高。结论：rhBMP-2和b—FGF联合应用时对HBMSC的增殖和向成骨细胞分化具有协同作用。     

重组人骨形成蛋白-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞增殖分化影响的实验研究

目的明确重组人骨形成蛋白(rhBMP)-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和分化的影响。方法在rhBMP-2纳米微球作用于BMSCs后,采用嗜银蛋白(AgNORs)染色法检测细胞的增殖状况;采用反转录PCR方法,观察细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA水平表达的改变以反映对细胞分化的影响,并与单纯rhBMP-2作用细胞后的结果进行比较。结果该纳米微球缓释系统能显著促进BMSCs的增殖以及细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA水平的表达,且均高于单纯rhBMP-2的作用。结论rhBMP-2纳米微球缓释系统促进BMSCs增殖以及向成骨细胞方向分化的作用强于单纯rhBMP-2的作用。     

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性

目的：研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及基成骨细胞表型特征。方法：分离大鼠四肢长骨髓基质细胞,常规和矿化培养液培养,测定细胞生长曲线,碱性成纤细胞生长因子（bFGF）、重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2)及矿化培养液对骨髓基质细胞性磷酸酶（ALP）活性的影响,观察矿化结节的形成。结果：大鼠骨髓基质细胞群体倍增时间（DT）为66．1h;在矿化液培养条件下细胞DT为50．3h。bFGF和rhBMP－2均不同程度增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性。矿化液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,用茜素红染色法显示较多的深红色矿化结节。常规培养条件下大鼠骨髓基质细胞生长虽呈现密集单层,没有矿化结节形成。结论：大鼠骨髓基质细胞在体外可以稳定传代培养,在矿化培养液诱导培养条件下可以向成骨细胞分化,bFGF和rhBMP－2有助于骨髓基质细胞表现成骨细胞表型特征,提示骨髓基质细胞在骨移植研究领域有重要的应用价值。     

气电纺聚羟基丁酸酯支架用于大鼠骨髓基质细胞体外培养的研究

目的研究气电纺聚羟基丁酸酯[poly（3-hydroxybutyrate）,PHB]纳米纤维支架的体外生物相容性。方法实验组用PHB纳米纤维支架接种大鼠骨髓基质细胞进行体外培养,对照组用培养板培养孔接种大鼠骨髓基质细胞进行体外培养,通过扫描电镜、四甲基偶氮唑盐比色法以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）检测来评价PHB纳米纤维支架对大鼠骨髓基质细胞粘附、增殖活性以及ALP活性的影响。结果气电纺PHB纳米纤维支架材料对大鼠骨髓基质细胞具有良好的亲和性;与细胞培养板相比,气电纺PHB纳米纤维支架材料上的大鼠骨髓基质细胞具有较高的增殖活性及ALP活性。结论气电纺PHB纳米纤维支架有望用作骨组织工程支架材料。     

rhBMP-2诱导成肌细胞表达成骨表型的研究

目的：检测不同浓度rhBMP-2对诱导成肌细胞成骨表型表达的影响，探索诱导成肌细胞表达成骨表型的rhBMP-2的最适浓度。方法：采用双重酶消化法获取SD大鼠乳鼠的成肌细胞，纯化后，在含15％胎牛血清的DMEM培养液中培养。取第3代培养细胞，按培养液中不同rhBMP-2浓度分组，分为0、0．1、0．5、1．0、1．5和5．0μg／ml共6组（0μg/ml组为对照组1，培养1、2和4周。收集不同时期细胞培养上清液和细胞爬片进行检测，检测指标为：细胞形态和数量、碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OCN）含量、Ⅰ型胶原合成量和钙化结节染色。采用SPSS10．0统计软件包进行统计分析。各组间比较采用方差分析（ANOVA）。结果：应用rhBMP-2后，梭形成肌细胞减少，圆形或多突形成肌细胞明显增加，细胞呈集结性生长，培养4周可形成不透光结节。低、中浓度（0．1-1．5μg／ml）rhBMP-2组细胞数量和对照组之间无显著性差异（P〉0．05），但高浓度（5．0μg／ml）rhBMP-2组细胞数量显著下降（P〈0．05）。0．1～1．5μg／ml 4组rhBMP-2均能促进成肌细胞合成分泌ALP、OCN和Ⅰ型胶原（所有组与对照组比较，P〈0．05），其中0．5和1．0μg/ml 2组促进作用更显著。细胞培养4周后，茜素红S染色法示结节呈红色钙阳性反应。结论：低、中浓度（0．1～1．51μg／ml）rhBMP-2对成肌细胞增殖无显著影响，但高浓度（5．0μg/ml）rhBMP-2可显著抑制成肌细胞增殖。rhBMP-2可有效诱导成肌细胞表达成骨细胞各项表型并能体外成骨，其中0．5～1．01μg／ml是一个较为适宜的诱导浓度。     

Bio-oss胶原与骨髓基质细胞相容性的实验研究

目的：探讨Bio-oss胶原与骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）的生物相容性,为用组织工程技术修复牙周缺损提供理论依据。方法：体外培养恒河猴BMSCs,将BMSCs与Bio-oss胶原复合进行体外培养。用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞与材料的黏附,MTT法检测细胞的增殖,并行碱性磷酸酶（ALP）活性测定。采用SAS6.12软件包对所得数据进行t检验。结果：BMSCs能黏附于Bio-oss胶原上;MTT结果显示,在2d、5d时,对照组和实验组间无显著性差异（P〉0.05）,8d时,两组间有显著性差异（P〈0.05）;在各时间点,对照组和实验组间ALP活性均无显著性差异（P〉0.05）。结论：Bio-oss胶原与恒河猴BMSCs有良好的生物相容性,可作为组织工程材料应用于牙周骨缺损的修复。     

rhBMP-2/PLA复合涂层种植体骨内诱导成骨的实验研究

目的：观察基因重组人骨形成蛋白-（recombinanthuman bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）和聚乳酸（polylactic acid，PLA）复合形成的活性涂层种植体骨内诱导成骨活性。方法：将rhBMP-2与聚乳酸复合构建活性涂层种植体，植入兔股骨内，分别于4，8，12，16周处死动物，进行组织学及扫描电镜及组织化学观察，检测其成骨活性。结果：构建的活性涂层种植体具有骨诱导能力，PLA为rhBMP-2的良好控释载体。结论：rhBMP-2/PLA涂层具有良好的生物相容性和骨诱导活性，是一种理想的种植体形式。     

rhBMP-2/rhTGF-β1联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响

目的：探讨转化生长因子β(trabsfirnubg griwtg factirs beta,TGF—β)、与骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。方法：体外培养兔成骨样细胞,采用四唑盐比色法和碱性磷酸酶试剂盒检测两种生长因子对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。结果：100ng／ml rhBMP-2促进兔成骨样细胞的分化,对增殖无明显作用。不同浓度的rhTGF-β1均可促进成骨样细胞的增殖,对分化无明显作用。二在同时应用时,其作用部分或完全抵消。结论：在本实验条件下,rhBMP-2、rhTGF-β1联合应用时无协同效应。     

神经生长因子对骨髓基质细胞成骨活性的影响

目的 探讨神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对骨髓基质细胞成骨活性的影响.方法 原代培养SD大鼠四肢骨骨髓源性骨髓基质细胞.通过检测细胞增殖、定量检测碱性磷酸酶的表达及茜素红矿化结节染色,观察NGF对骨髓基质细胞增殖及成骨活性的影响.结果 实验组与对照组细胞增殖无统计学差异,NGF对骨髓基质细胞增殖无促进作用.第3天时,实验组细胞分化及碱性磷酸酶的表达高于对照组（P＜0.05）.钙结节茜素红染色及钙结节量实验组大于对照组.结论 NGF可直接促进骨髓基质细胞的成骨向转化及矿化作用,对细胞增殖无促进作用.     

不同浓度bFGF对犬骨髓基质细胞增殖、分化影响的实验研究

目的：研究不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factot,bFGF）对体外培养的beagle犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal ceils，BMSCs）增殖和分化的影响。方法：体外培养第2代BMSCs的培养液中分别加入不同浓度（25、50、100、200ng／mL）的bFGF，连续6d倒置显微镜下动态观察BMSCs的形态和生长情况．行MTT比色、碱性磷酸酶（alkalin ephosphatase，ALP）活性定量检测、ALP和Von Kossa染色。结果：浓度为50ng／mL的bFGF可明显促进犬的BMSCs增殖（P〈0．05），但无显著促进犬BMSCs分化的作用（P〉0．051。结论：bFGF能有效促进犬BMSCs的增殖，且与bFGF剂量有关。     

骨髓基质细胞的体外培养和成骨方向的诱导分化

目的:体外分离狗的骨髓基质细胞,诱导其成骨分化并鉴定成骨活性.方法:体外分离培养狗的骨髓基质细胞,传代培养中加入10-8rnol/L地塞米松、50 μg/ml维生素C和10mmol/L β-甘油磷酸钠进行诱导分化,进行细胞形态和增殖观察,矿化结节Von Kossa染色,细胞碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测其成骨活性.结果:骨髓基质细胞经诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化结节Von Kossa钙染色阳性;传代细胞碱性磷酸酶染色阳性,酶活性＞80%,Ⅰ型胶原免疫组化染色强阳性.结论:体外分离培养的骨髓基质细胞中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能.     

骨形成蛋白—2和碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的联合效应

目的了解重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单独和联合作用对人牙周膜细胞（PDLC）碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法体外培养人PDLC,分别用不同浓度的rhBMP-2和bFGF单独或联合作用,用酶动力学方法检测PDLC的ALP活性。结果50～200μg/L浓度的rhBMP-2可显著增强人PDLC的ALP活性（P<0.01）,而10μg/L浓度的bFGF可显著抑制人PDLC的ALP活性(P<0.01),rhBMP-2和bFGF联合作用仍可较明显地增强人PDLC的ALP活性（P<0.05）。结论rhBMP-2和bFGF联合应用可增强人PDLC的ALP活性。     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。