自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡

目的:探讨自噬在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)凋亡中的作用。方法:常规培养HPAECs,分为对照组、CSE组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组和3-MA+CSE组,应用Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察细胞自噬泡形成,Western bolt测定自噬相关蛋白beclin-1、LC3与cleaved caspase-3的水平。结果:MDC染色示CSE处理可以诱导细胞产生自噬泡,Western blot结果示自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达升高,3-MA预处理后抑制上述蛋白的表达。Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式结果显示CSE组细胞凋亡率较对照组明显增加,在3-MA+CSE组,细胞凋亡率较CSE组进一步升高;同时,CSE组细胞cleaved caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P0.05),3-MA+CSE组的caspase-3表达较CSE组进一步升高。结论:CSE能诱导HPAECs发生自噬和凋亡,抑制自噬能够进一步促进CSE对HPAECs的凋亡作用,这种作用可通过激活caspase-3实现。     

3-甲基腺嘌呤对Aβ(25-35)引起的海马神经元凋亡的影响

目的: 探讨阿尔茨海默病(AD)大鼠海马神经元自噬对凋亡的影响。方法: SD大鼠随机分成模型组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理组和对照组。模型组大鼠用立体定位技术对海马CA1区微量注射Aβ(25-35)造成AD模型;3-MA预处理组大鼠在注射Aβ(25-35)之前对海马CA1区微量注射3-MA。Morris水迷宫检测大鼠记忆水平;行为学测试后,观察海马神经元超微结构变化、自噬泡的形成、beclin-1的表达以及细胞凋亡情况。结果: 3-MA预处理组与模型组比较,大鼠学习记忆能力显著下降(P<0.05),海马神经元凋亡率显著增加(P<0.05),而beclin-1的表达量减少;模型组海马神经元可见双层膜包裹形成的自噬泡,神经元破坏程度明显轻于3-MA预处理组。结论: 抑制神经元自噬水平增加神经元凋亡;诱导神经元自噬可能是防治阿尔茨海默病的一个潜在方法。     

3-甲基腺嘌呤对顺铂诱导HeLa细胞凋亡的影响

目的 采用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬,观察其对顺铂(DDP)诱导HeLa细胞凋亡的影响,探讨自噬在DDP诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡中的作用.方法 用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察3-MA对DDP抑制HeLa细胞生长情况的影响;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白LC3和p62的变化;Hoechst荧光染色检测细胞凋亡.结果 MTT法显示,3-MA与DDP联合应用导致HeLa细胞生长抑制率增加;光镜结果显示,3-MA与DDP联合应用加剧了HeLa细胞收缩变圆,促进死亡;间接免疫荧光法检测到3-MA与DDP联合应用减弱了DDP诱导的HeLa细胞LC3聚集及其与p62的共定位;Hoechst荧光染色检测到3-MA与DDP联合应用增加HeLa细胞凋亡率.结论 3-MA抑制自噬能够促进DDP诱导HeLa细胞发生凋亡.     

光敏化促进姜黄素诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡

目的: 探讨光敏化促进姜黄素诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡及其机制。方法: 用MTT法检测光敏化姜黄素对胃癌MGC-803细胞株的增殖抑制率,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡率、线粒体膜电位、细胞内活性氧和Ca²⁺;比色法检测caspase-3、8和9酶活性;Western blotting分析细胞色素C、Bcl-2、Bax和热休克蛋白70(HSP70)水平。结果: 单纯姜黄素(5.0μmol/L)对MGC-803细胞增殖抑制率为(29.74±2.30)%,在光学显微镜下可见部分凋亡细胞,凋亡率为(12.54±1.75)%。而光敏化姜黄素组细胞增殖抑制率则为(44.93±3.61)%,在光学显微镜下能见明显细胞核形态改变,染色质凝集,凋亡小体形成,凋亡率为(26.58±2.67)%,细胞周期主要阻滞于G₀/G₁期。光敏化姜黄素显著降低线粒体膜电位,显著增加细胞色素C、细胞内活性氧和Ca²⁺以及caspase-3、8和9酶活性,与单纯姜黄素组比较,差异显著(P<0.01)。Western blotting结果显示光敏化姜黄素同时显著抑制Bcl-2和HSP70蛋白表达水平。结论: 光敏化姜黄素通过Bcl-2和线粒体途径增强其诱导胃癌MGC-803细胞凋亡的作用。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神经胶质瘤U251细胞损伤中的作用

目的: 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)在H₂O₂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤过程中的作用。方法: 实验分为4组:正常对照组、10 mmol/L 3-MA组、1 mmol/L H₂O₂组、1 mmol/L H₂O₂ +10 mmol/L 3-MA组。MTT法检测各组的U251细胞增殖率;MDC染色检测细胞自噬空泡的变化;Hoechst 33342染色检测细胞核染色质凝聚变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果: 与对照组相比,单独应用3-MA对U251细胞无明显影响。H₂O₂作用组U251细胞增殖率明显降低,细胞内出现自噬空泡,细胞核染色质凝聚,细胞凋亡率增加。3-MA与H₂O₂联合作用于U251细胞时,与单独应用H₂O₂组相比,抑制了H₂O₂引起的胞内自噬空泡的积聚,但细胞凋亡率明显增加。结论: 自噬抑制剂3-MA能够一定程度地抑制H₂O₂诱导的U251细胞自噬,但促进了细胞凋亡,表明自噬在H₂O₂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤过程中很可能起到保护性作用。     

血管紧张素Ⅱ升高血管内皮细胞中ROS水平并激活自噬通路

目的: 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管内皮细胞自噬的影响及其可能机制。方法: 以EA.hy926血管内皮细胞为研究对象,荧光酶标仪检测AngⅡ(10^-7mol/L)、AngⅡ联合N-乙酰半胱氨酸(NAC,50 μmol/L)作用24 h后细胞中活性氧簇(ROS)水平;用不同浓度(10^-8、10^-7、10^-6mol/L)AngⅡ作用24 h或10^-7mol/L AngⅡ作用不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h)后,通过Western blotting分析微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白变化、吖啶橙染色结合荧光显微镜观察自噬体形成情况来判断细胞中自噬发生情况;AngⅡ(10^-7mol/L)联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,2 mmol/L)或NAC(50 μmol/L)处理24 h后用同样方法检测细胞中自噬的发生情况。结果: 细胞经AngⅡ刺激后细胞内ROS的水平显著升高(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白表达明显增强(P<0.05),自噬体形成明显增加;3-MA或NAC可显著抑制内皮细胞中AngⅡ诱导的LC3-Ⅱ蛋白表达(P<0.05)与自噬体形成。结论: AngⅡ可以通过升高血管内皮细胞内ROS的水平从而诱导自噬的发生。     

自噬在熊果酸诱导的人脐静脉内皮细胞损伤中的作用

目的: 研究自噬在熊果酸诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤中的作用。方法: 体外培养HUVECs,运用不同浓度的熊果酸处理36 h,采用MTT法检测HUVECs增殖率的变化;透射电镜观察细胞超微结构的改变;单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色观察熊果酸对HUVECs自噬表达水平的影响;Western blotting检测微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)及自噬相关蛋白Beclin-1的变化;RT-PCR检测LC3及Beclin-1 mRNA的变化;流式细胞术检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)抑制自噬前后经熊果酸处理的HUVECs凋亡率的变化。结果: 熊果酸抑制HUVECs增殖并呈剂量依赖性;熊果酸可诱导HUVECs产生自噬:透射电镜和MDC染色均显示HUVECs经熊果酸处理后自噬囊泡明显增加且自噬在基因及蛋白水平的表达均增加;3-MA与熊果酸联合作用于HUVECs时抑制了熊果酸诱导的HUVECs自噬空泡的积聚并且可明显促进HUVECs凋亡。结论: 熊果酸抑制HUVECs增殖,并诱导其发生自噬,自噬在此过程中对HUVECs起保护作用。自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸诱导的HUVECs的增殖抑制作用并且促进HUVECs发生凋亡。     

血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体通过上调自噬诱导INS-1胰岛β细胞凋亡

目的:本研究旨在探究血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(AT1-AA)能否引起胰岛β细胞的凋亡,自噬是否参与其中以及其所发挥的作用。方法:10-6mol/L AT1-AA处理INS-1细胞24 h后,用流式细胞术、Western blot及Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡水平;Western blot检测自噬相关蛋白LC3和beclin 1的蛋白水平。使用血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂替米沙坦以及经典的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理细胞1 h之后再加入AT1-AA处理24 h,检测细胞凋亡、自噬及存活率的变化情况。结果:10-6mol/L AT1-AA处理INS-1细胞24 h可明显降低细胞存活率(P0.05)。与阴性Ig G对照组相比,AT1-AA分别处理细胞12 h、24 h和36 h后细胞凋亡水平明显增高(P0.05);此外,LC3及beclin 1的蛋白水平也随处理时间的延长逐渐升高,且凋亡和自噬水平的升高均可被替米沙坦所阻滞。使用自噬抑制剂3-MA预处理之后,细胞的凋亡率较单独给予AT1-AA处理组明显降低(P0.05)。结论:AT1-AA可通过血管紧张素Ⅱ1型受体上调自噬来诱导INS-1胰岛β细胞凋亡。     

辐射诱导大鼠脑损伤后星形胶质细胞活性及其自噬的变化

目的:探究辐射诱导大鼠脑损伤后星型胶质细胞活性及其自噬的相关变化。方法:取36只体质量为180～200 g的Sprague-Dawley大鼠,进行4 d的Morris水迷宫训练后,随机分为假手术(sham)组、模型(model)组及3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,其中model组及3-MA组大鼠经腹腔麻醉后给予单次全脑X线照射,剂量为20 Gy。照射完成后,model组侧脑室注射5μL Na Cl,3-MA组侧脑室注射600 nmol 3-MA,饲养8周,用Morris水迷宫进行学习和记忆能力测评后,断头取脑,HE染色观察海马区病理变化。用GFAP的免疫组化和Western blot检测星形胶质细胞活性;用GFAP及LC3的双重荧光染色评定星形胶质细胞自噬的变化; Western blot法测定cleaved caspase-3蛋白水平的变化,TUNEL检测同侧海马区细胞凋亡情况; ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平以评估海马区炎症反应。结果:辐射可抑制星形胶质细胞活性,激活星形胶质细胞自噬,加重脑组织损伤。3-MA可促进星形胶质细胞的活化,促进脑组织损伤的修复。结论:大鼠放射性脑损伤后海马区损伤明显,星形胶质细胞数量明显减少,3-MA可显著缓解受损程度。该发现可能会为放射性脑损伤的治疗提供新途径。     

自噬通过抑制凋亡促进体外饥饿状态下脂肪细胞存活

 目的: 观察体外饥饿状态下脂肪细胞的自噬变化,研究自噬在维持体外饥饿状态下脂肪细胞存活中的作用。方法: 将小鼠3T3-L1细胞诱导成为脂肪细胞后,雷帕霉素(rapamycin,RAP)预处理脂肪细胞,在缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation,OGD)模拟的饥饿环境中孵育细胞。应用Western blotting及透射电镜法检测细胞自噬变化,用TUNEL染色及Western blotting检测脂肪细胞凋亡。结果: OGD条件下脂肪细胞的自噬水平明显升高,RAP预处理进一步上调了OGD条件下的细胞自噬。与对照组相比,OGD组细胞cleaved caspase-3的水平及细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。RAP预处理降低了OGD 条件下cleaved caspase-3的水平,并明显降低了细胞凋亡率(P<0.05)。结论: 自噬在饥饿状态下脂肪细胞存活中发挥保护性作用,提高自噬水平有助于降低饥饿状态下脂肪细胞的凋亡水平。     

饥饿诱导增生性瘢痕成纤维细胞自噬发生

 ［摘要］目的:探讨饥饿诱导的增生性瘢痕成纤维细胞自噬的发生。方法:原代培养增生性瘢痕成纤维细胞至对数生长期,用EBSS（Earle’s balanced salt solution）代替培养液,分别饥饿0 h、1 h、2 h、3 h,应用Western blotting和定量PCR(qRT-PCR)方法分别检测成纤维细胞微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC-3）和自噬相关蛋白Beclin-1的蛋白和mRNA表达,单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色和透射电镜观察自噬体。结果:Western blotting和qRT-PCR 检测LC3和Beclin-1 蛋白和mRNA表达在饥饿1 h开始增加,2 h达到高峰,3 h逐渐下降,均明显大于对照组（P<0.05）。荧光显微镜和电镜下观察到饥饿2 h诱导的成纤维细胞出现自噬囊泡。结论: 饥饿可诱导增生性瘢痕成纤维细胞发生自噬,可能与增生性瘢痕的形成有关。     

自噬在晚期糖基化终产物诱导的内皮细胞凋亡中的作用

目的: 研究晚期糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬水平的影响并探讨自噬在AGEs诱导的内皮细胞凋亡中的作用。方法: 用AGEs处理HUVECs,相同条件牛血清白蛋白处理为对照组,Western blotting检测相应蛋白表达的变化,电镜观察细胞自噬体的出现,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT比色法测定细胞活性。结果: AGEs处理HUVECs后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达显著上调并呈时间和浓度依赖性,电镜观察到细胞胞浆内自噬体数量增加;与对照组比较,AGEs处理组内皮细胞凋亡率增加,活性下降,自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤预处理的AGEs组细胞活性较AGEs组进一步下降,凋亡率继续增加。AGEs处理HUVECs后,蛋白激酶B(Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平也明显下调, Akt激活剂胰岛素样生长因子1预处理后,Akt的磷酸化水平增加,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的增高表达被抑制。结论: AGEs通过PI3K/Akt/mTOR介导的信号通路诱导HUVECs自噬水平升高。自噬在AGEs诱导的内皮细胞凋亡中对细胞起保护作用。     

人椎间盘髓核细胞增殖活性与益肾活血通络方的干预调控

背景:NF-κB信号通路与椎间盘退变的关系是骨科学术界研究热点,深入研究椎间盘中各种信号通路的作用,有助于了解椎间盘退变的发生机制。目的:通过研究不同静水压压力下益肾活血通络方含药血清对人椎间盘髓核细胞NF-κB信号通路的调控作用,以期能从分子生物学角度探讨益肾活血通络方治疗椎间盘退变性疾病的可能机制及作用靶点。方法:将第3代人椎间盘髓核细胞分为8组,分别加入益肾活血通络方含药血清,在体外不同静水压加载条件(0.3,1,3 MPa)下作用2,4,6 h后,使用倒置相差显微镜观察椎间盘髓核细胞的形态及生长状况;使用透射电镜观察椎间盘髓核细胞的超微结构;采用CCK-8法检测各组髓核细胞的增殖活性;采用Annexin V-FITC/Propidium Iodide凋亡试剂盒检测髓核细胞的凋亡率;采用Western blot法检测髓核细胞内NF-κB p65、CollagenⅡ、ADAMTS-4、MMP-13、Caspase-3的表达。结果与结论:①在同一压力及作用时间下压力+中药血清组髓核细胞形态较常压组、单纯压力组更完整,生长状况更好,其中0.3,1 MPa压力+中药血清组优于3 MPa压力+中药血清组;②压力+中药血清组髓核细胞增殖活性更高,其中0.3 MPa压力+中药血清组与0.3 MPa单纯压力组比较差异有显著性意义(P<0.05);③压力+中药血清组椎间盘髓核细胞的凋亡率较常压组、单纯压力干预组低(P<0.05);④与单纯压力组比较,压力+中药血清组CollagenⅡ、Caspase-3表达增加,NF-κB p65、ADAMTS-4、MMP-13表达减少(P<0.05);⑤结果表明,益肾活血通络方能增加细胞活性,减少细胞凋亡,有效延缓髓核细胞的退变,其机制可能与椎间盘髓核细胞NF-κB信号通路促进CollagenⅡ、Caspase-3表达,抑制NF-κB p65、ADAMTS-4、MMP-13表达有关。     

自噬在巨噬细胞清除凋亡淋巴细胞中的作用

目的研究巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞后自噬结构的形态学特征,探讨自噬对巨噬细胞清除凋亡细胞的作用。方法用环磷酰胺诱导淋巴细胞凋亡。在扫描电子显微镜下观察巨噬细胞吞噬凋亡细胞的形态学变化,透射电镜下观察巨噬细胞内的自噬前体、自噬体和自噬溶酶体的结构特点,用图像分析仪测量自噬结构的断面面积。以单丹磺酰尸胺(MDC)染色法标记巨噬细胞的自噬体,在激光扫描共焦显微镜下观察和定量分析。结果巨噬细胞活跃地吞噬凋亡淋巴细胞、凋亡细胞核、凋亡小体或其他细胞碎片,形成异噬体。与对照组比较,吞噬凋亡细胞组的自噬细胞及其自噬体数目增多,自噬前体、自噬体和自噬溶酶体与细胞质的断面面积之比增大。许多自噬体内可见凋亡小体或其他细胞碎片,这些自噬体的体积较大,多位于细胞膜下。未观察到含有整个凋亡细胞或凋亡细胞核的自噬体。结论巨噬细胞清除凋亡淋巴细胞时自噬功能显著增强。自噬对于凋亡淋巴细胞的清除起着重要的直接和间接作用。     

黄芪甲苷对脑缺血/再灌注损伤大鼠细胞自噬的影响

目的:探讨黄芪甲苷对脑缺血/再灌注损伤大鼠细胞自噬的影响。方法:选取清洁级雄性SD大鼠70只随机分为假手术组、脑缺血/再灌注组、溶剂对照组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组。采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型。观察大鼠神经缺损症状,根据Zea Longa评分标准挑选模型成功的大鼠;采用TTC染色法检测大鼠脑梗死体积;尼氏染色观察大鼠神经细胞形态学变化;透射电子显微镜观察细胞自噬现象;Western blot检测beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达量的变化。结果:假手术组无神经缺损症状,未出现脑梗死灶,尼氏体丰富、染色均匀。与假手术组相比,脑缺血/再灌注组出现明显的脑梗死灶,神经细胞坏死增多,尼氏体数量减少、着色较浅,透射电镜下可见典型的自噬体,自噬标志蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ表达增加(P 0. 05)。与脑缺血/再灌注组相比,黄芪甲苷组和自噬激活剂组可明显减小脑梗死体积,神经细胞有不同程度的恢复,尼氏体稍增多,自噬体数量、beclin-1和LC3-Ⅱ表达量均增加(P 0. 05);自噬抑制剂组脑梗死体积增大,神经细胞坏死严重,尼氏体减少,着色变浅,自噬体数量、beclin-1和LC3-Ⅱ表达量均减少(P 0. 05);溶剂对照组无明显变化。与黄芪甲苷组比较,黄芪甲苷+自噬抑制剂组和自噬抑制剂组脑梗死体积增加,神经细胞坏死增多,尼氏体数量减少,自噬体数量、beclin-1和LC3-Ⅱ表达量降低(P 0. 05)。结论:黄芪甲苷可通过激活自噬而减轻脑缺血/再灌注损伤,从而发挥神经保护作用。     

谷氨酸致原代培养皮层神经元损伤中自噬的激活

目的: 体外观察谷氨酸介导的神经元氧化性损伤中自噬的激活,以及抑制自噬对谷氨酸致神经元毒性损伤的保护作用。方法: 体外培养皮层神经元,给予谷氨酸以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预,MTT法检测细胞活力,透射电镜观察自噬泡的产生,激光共聚焦显微镜观察自噬特异性蛋白LC3的表达。结果: 给予谷氨酸干预后皮层神经元细胞存活率下降,自噬体数目明显增加,自噬标志性蛋白LC3表达增加。给予3-甲基腺嘌呤后,神经元细胞存活率增加,细胞自噬水平下降。结论: 谷氨酸诱导的神经元毒性损伤中存在自噬相关性细胞死亡,抑制自噬可能对谷氨酸毒性损伤有抑制作用,自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤具有一定的神经保护作用。     

自噬参与低氧预处理抗PC12细胞糖氧剥夺损伤过程

目的:观察低氧预处理(HPC)对氧糖剥夺(OGD)损伤的PC12细胞的作用,同时探讨自噬在其中的作用。方法:培养的PC12细胞按照处理因素分为6组:对照组、HPC模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、低氧预处理后氧糖剥夺(HPC+OGD)组、3-甲基腺嘌呤预处理后行低氧预处理及氧糖剥夺(3-MA+HPC+OGD)组和OGD组。CCK-8检测细胞存活率;caspase-3活性检测试剂盒检测酶活性;TUNEL染色和流式细胞术检测细胞凋亡的情况;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、beclin-1和凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果:与对照组相比,OGD组细胞存活率明显降低;与3-MA+HPC+OGD组及OGD组相比,HPC+OGD组细胞存活率明显升高(P0.05)。与对照组相比,OGD组细胞的caspase-3酶活性明显升高;与3-MA+HPC+OGD组及OGD组相比,HPC+OGD组的caspase-3酶活性明显降低(P0.05)。与对照组相比OGD组细胞凋亡明显增多;HPC+OGD组与OGD组相比凋亡明显减少(P0.05)。此外,与对照组相比,OGD组的激活型caspase-3蛋白水平明显升高(P0.05);且HPC+OGD组与OGD组相比激活型caspase-3蛋白水平明显减少而LC3、beclin-1的蛋白水平明显升高(P0.05)。结论:HPC抗OGD损伤的机制可能与其激活细胞自噬有关。