南方红豆杉愈伤组织培养条件的优化及紫杉醇积累的基因表达效应分析

目的 优化南方红豆杉愈伤组织诱导与继代培养条件,获得含紫杉醇量高的红豆杉愈伤组织,明确紫杉醇合成相关基因的表达模式与紫杉醇量的关系。方法 探讨了适合南方红豆杉的愈伤组织诱导及继代培养的激素组成及浓度。比较了南方红豆杉 (种胚、幼茎、幼芽)、曼地亚红豆杉 (种胚) 和太平洋红豆杉 (种胚) 不同外植体来源的愈伤组织的生长特点和紫杉醇的量,分析了不同愈伤组织紫杉醇合成相关基因的表达差异。结果 添加 3.0 mg/L 2,4-D 的 Murashige & Skoog (MS) 培养基有利于南方红豆杉的诱导,诱导率高于 92%。添加 2.0 mg/L 2,4-D 与 1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤 (6-BA) 的继代培养基有利于南方红豆杉的紫杉醇积累。同一培养条件下,南方红豆杉种胚来源的愈伤组织紫杉醇量最高,达到干质量的 0.027%。含紫杉醇量高的愈伤组织,其紫杉醇合成途径中的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 (GGPPS)、紫杉二烯合成酶 (TASY)、紫杉烷-10β-羟化酶 (T10βH)、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-β-O-乙酰转移酶 (DBAT)、苯丙氨酸氨基变位酶基因 (PAM)、去苯甲酰紫杉-N-苯甲酰转移酶 (DBTNBT) 等酶基因的表达水平高。结论 从南方红豆杉的种胚为外植体源获得了含紫杉醇量高的愈伤组织,提高 GGPPS、TASY、T10βH、DBAT、PAM、DBTNBT 的表达水平将促进紫杉醇的合成。     

天门冬组培快繁体系研究

目的 建立天门冬组培快速繁殖体系,保护和合理利用天门冬资源。方法 采用不同基本培养基和不同种类及质量浓度的植物生长调节剂对天门冬不同外植体进行愈伤组织诱导、丛生芽诱导及生根培养研究。结果 愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA,pH 5.8;丛生芽诱导的适宜培养基为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IAA,pH 5.8;生根的适宜培养基为1/2 MS＋0.5 mg/L IBA＋0.5 mg/L IAA,其中培养基中铁盐的质量浓度降低到6.95 mg/L,蔗糖的质量浓度降低至20 g/L,pH值为5.8。结论 天门冬不同外植体均可诱导出愈伤组织,其中嫩芽诱导愈伤率最高,为天门冬最适组织培养的外植体;利用组织培养技术能够实现天门冬快速繁殖,为其人工扩大栽培奠定了良好基础。     

南方红豆杉愈伤组织生长动力学及紫杉醇代谢动力学研究

目的 通过愈伤组织细胞生长及其紫杉醇代谢动力学的研究,筛选确定南方红豆杉愈伤组织培养生产紫杉醇的最佳培养基配方与最佳收获期。方法 以改良MS为基本培养基添加不同质量浓度的IBA、6-BA、GA₃组合诱导培养南方红豆杉愈伤组织,通过测定愈伤组织鲜质量进行生长动力学研究,采用HPLC法检测不同生长阶段愈伤组织中紫杉醇的积累量,进行紫杉醇代谢动力学研究。结果 改良MS＋0.2 mg/L IBA＋0.05 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L GA₃、MS＋0.2 mg/L IBA＋0.01 mg/L 6-BA＋0.7 mg/L GA₃及MS＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA₃培养条件均较有利于南方红豆杉愈伤组织的诱导培养,且紫杉醇的积累量也较高,最高可达0.037 76%。结论 在添加IBA及6-BA的基础上适当增补GA₃可使南方红豆杉愈伤组织诱导提前启动,缩短出愈时间,促进生长,降低褐变程度,增加愈伤组织中紫杉醇的积累量。愈伤组织的生长曲线呈S型,紫杉醇的积累呈线型增加,是一个逐渐积累的过程,但积累到一定程度就不再增加,且伴随着愈伤组织不断褐变。     

大量元素和植物生长物质对怀牛膝愈伤组织生长及多糖量的影响

目的 研究大量元素和植物生长物质对怀牛膝愈伤组织生长及怀牛膝多糖量的影响。方法 以怀牛膝无菌苗的叶片、茎段为材料,采用正交试验设计方法研究培养基中大量元素和植物生长物质6-BA、IBA、NAA和2,4-D对怀牛膝愈伤组织生长的影响,并在愈伤组织形成高峰期30 d时,采用酚-硫酸比色法对其中多糖的量进行检测,对所得实验数据进行极差分析、方差分析比较。结果 大量元素的添加量对愈伤组织的诱导、生长和多糖的量无显著影响,6-BA对怀牛膝愈伤组织多糖量影响影响显著。结论 诱导怀牛膝愈伤组织形成多糖的适宜培养基是1/4MS+6-B A0.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L。     

白芨愈伤组织诱导、增殖与分化研究

目的 建立白芨愈伤组织诱导、增殖和分化再生体系。方法 以MS为基本培养基,应用正交试验方法设计植物生长调节剂组合和质量浓度配比,研究不同外植体及植物生长调节剂对白芨愈伤组织形成、增殖和分化的影响。结果 白芨假鳞茎为诱导愈伤组织形成的最佳外植体;1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）与2.0 mg/L 2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D）组合不仅可诱导白芨愈伤组织形成,还有利于愈伤组织分化成芽。1.0 mg/L 6-BA与3.0 mg/L 2, 4-D的组合促进愈伤组织增殖,增殖系数为7.8;在分化培养基中附加0.5 mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）,可提高愈伤组织分化率。结论 白芨愈伤组织诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2, 4-D 2.0 mg/L;最佳增殖培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2, 4-D 3.0 mg/L;分化最佳培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2, 4-D 2.0 mg/L＋TDZ 0.5 mg/L。     

白芨愈伤组织诱导、增殖与分化研究

目的 建立白芨愈伤组织诱导、增殖和分化再生体系。方法 以MS为基本培养基,应用正交试验方法设计植物生长调节剂组合和质量浓度配比,研究不同外植体及植物生长调节剂对白芨愈伤组织形成、增殖和分化的影响。结果 白芨假鳞茎为诱导愈伤组织形成的最佳外植体;1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）与2.0 mg/L 2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D）组合不仅可诱导白芨愈伤组织形成,还有利于愈伤组织分化成芽。1.0 mg/L 6-BA与3.0 mg/L 2, 4-D的组合促进愈伤组织增殖,增殖系数为7.8;在分化培养基中附加0.5 mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）,可提高愈伤组织分化率。结论 白芨愈伤组织诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2, 4-D 2.0 mg/L;最佳增殖培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2, 4-D 3.0 mg/L;分化最佳培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2, 4-D 2.0 mg/L＋TDZ 0.5 mg/L。     

番红花组织培养及快速繁殖研究

目的 为番红花的快速繁殖提供依据。方法 添加不同种类及不同浓度的激素,对番红花进行愈伤组织诱导、丛生芽诱导及球茎培养。结果 愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA;丛生芽诱导的适宜培养基为MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA;在光照条件下,丛生芽可分化出小球茎。结论 利用组织培养技术能够实现番红花快速繁殖。     

波棱瓜愈伤组织诱导及植株再生研究

目的 研究波棱瓜愈伤组织诱导、分化及生根的条件,探讨波棱瓜快速繁殖新途径,为波棱瓜组织培养与离体植株再生奠定基础。方法 以波棱瓜幼嫩茎段和叶片为材料,比较不同外植体、基本培养基及植物生长调节剂对波棱瓜愈伤组织诱导、分化及生根的影响。结果 幼嫩茎段作为外植体时,其出愈率较叶片高,愈伤量大;MS基本培养基能够产生明显的愈伤组织,出愈率较高;幼嫩茎段愈伤组织诱导适宜的培养基为MS＋6-BA 2 mg/L＋NAA 0.5 mg/L,出愈率达93.3%。愈伤组织的最佳分化培养基为MS＋6-BA 2 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋KT 3.0 mg/L,分化率达87.2%。生根培养的适宜培养基为1/2 MS＋NAA 1.0 mg/L,生根率达95%。结论 波棱瓜幼嫩茎段在适宜的培养基中可通过愈伤组织途径分化不定芽,且极易生根,能够得到正常生长发育的再生植株。     

植物生长调节剂对东北矮紫杉愈伤组织中次生代谢物质的影响

目的 使用植物生长调节剂提高东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇和 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量。方法 以东北矮紫杉幼茎为外植体,运用正交试验优选 NAA、2,4-D 和 6-BA 3 种植物生长调节剂组合培养植物愈伤组织,HPLC 法测定愈伤组织中紫杉醇和 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量。结果 植物生长调节剂对东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇和 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成的影响顺序是：NAA＞6-BA＞2,4-D。结论 利用东北矮紫杉愈伤组织培养生产紫杉醇和 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的最佳培养基为：B₅+NAA 2.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。     

盐胁迫对长春花愈伤组织生长及阿玛碱积累的影响

目的 研究盐胁迫对长春花愈伤组织生长及阿玛碱积累的影响。方法 用浓度为0、50、100、150 mmol/L的NaCl处理长春花愈伤组织,测定其鲜质量、干质量、丙二醛（MDA）量、光合速率、呼吸速率等生理指标和阿玛碱的量。结果 盐胁迫显著地降低了长春花愈伤组织的鲜质量和干质量,提高了MDA量、光合速率和呼吸速率;在含有不同浓度NaCl的培养基上生长30 d后,愈伤组织的阿玛碱量随NaCl浓度的增加而逐渐降低;用不同浓度的NaCl溶液喷洒生长27 d的愈伤组织,发现3 d后50 mmol/L处理的愈伤组织中阿玛碱量比对照高出近1倍。结论 长期盐胁迫能够抑制长春花愈伤组织的生长,同时引起阿玛碱积累的减少;低浓度NaCl喷洒处理则对长春花细胞中阿玛碱的积累有较大的促进作用。     

四倍体平贝母的诱导及鉴定

目的 运用组织培养技术诱导平贝母四倍体。方法 采用不同质量浓度（200、500、1 000、2 000 mg/L）秋水仙素和不同的诱导时间（12～72 h）处理平贝母愈伤组织。结果 离体培养条件下,平贝母激素自养型培养材料在秋水仙素诱导下得到四倍体,四倍体染色体4n＝44,四倍体植株出现明显的多倍体特征。结论 500 mg/L秋水仙素处理24 h为最佳组合,可以诱导四倍体平贝母以平贝母子球做鉴定材料,获得较好的结果。     

蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉蛋白质氨基酸分析及质量评价

目的 对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)和中国弯颈霉(Tol ypocladium sinenis)2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸进行含量分析及质量评价,为2种真菌的其他相关研究和应用提供依据.方法 采用盐酸水解法水解菌丝粉,用Agilent 1200高效液相色谱仪C18反相柱梯度进行分离,上柱前加入邻苯二甲醛-氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC)自动衍生化.参照标准品氨基酸,计算待测样品的氨基酸含量.结果 测定了17种蛋白水解氨基酸的含量,其中蝙蝠蛾拟青霉中有4种氨基酸(天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)的含量高于中国弯颈霉,中国弯颈霉中有11种氨基酸(谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、脯氨酸)的含量高于蝙蝠蛾拟青霉.中国弯颈霉氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸总量高于蝙蝠蛾拟青霉,蝙蝠蛾拟青霉支链氨基酸含量高于中国弯颈霉.两者必需氨基酸的模式均符合世界卫生组织和联合国粮农组织(WHO/FAO)提出的必需氨基酸模式谱和参考标准.结论 蝙蝠蛾拟青霉与中国弯颈霉均具有较高的营养价值,但两者的蛋白质氨基酸含量并不等同.     

环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草

目的 建立冬虫夏草的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,实现对冬虫夏草的快速检测。方法 针对冬虫夏草的CS2 serine protease (csp2)基因设计LAMP内外引物对;利用CTAB法提取冬虫夏草DNA;优化扩增反应条件;采用包括冬虫夏草在内的6种不同虫草进行LAMP扩增,并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性,通过对模板DNA的10倍梯度稀释检测其灵敏度;紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料SYBR Green I的扩增产物。结果 设计的LAMP引物可以特异地针对冬虫夏草的csp2基因进行LAMP扩增,产物可被限制性内切酶Taq1酶切,且有较高的灵敏度,检出限达6 pg/mL。结论 LAMP法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测,在中药鉴定中有着广阔的应用前景。     

海拔对当归中阿魏酸量的影响及关键因子分析

目的 在不同海拔进行当归Angelica sinensis生态适应性实验,探索影响当归阿魏酸积累的关键因子。方法 通过田间实验测定当归阿魏酸量的变化和生理生化指标、光合参数、生态因子。结果 当归根中阿魏酸量随海拔升高而增加,且海拔2 780 m处理比海拔2 360 m处理高14.5%,差异显著（P＜0.05）。分析影响当归阿魏酸积累的关键因子表明,降雨量（r＝0.898 8）和温度（r＝?0.799 1）是关键生态因子,可溶性糖（r＝?0.974 9）和超氧化物歧化酶（SOD）（r＝?0.840 8）是关键生理生化因子,湿度（r＝0.969 9）和光合活性辐射(r＝0.946 7)是关键光合参数因子。结论 适当升高种植海拔,增加降雨量和湿度,降低温度和可溶性糖量均有利于当归中阿魏酸的转化积累。     

牡荆苷对人食管癌EC-109细胞生长及凋亡的影响

目的 观察金莲花中提取的牡荆苷体外对人食管癌EC-109细胞生长及诱导EC-109细胞凋亡的作用,探讨p53及bcl-2蛋白表达在牡荆苷抗肿瘤细胞机制中的作用。方法 用不同浓度牡荆苷作用于对数生长期的EC-109细胞,通过CCK-8法检测其对EC-109细胞体外生长、增殖的抑制作用;Hoechst33258荧光染色观察细胞形态的变化;琼脂糖凝胶电泳检测DNA 条带;AnnexinV-FITC/PI双标法流式细胞术观察牡荆苷对EC-109细胞凋亡的诱导作用;流式细胞术检测EC-109细胞中抑癌基因p53和促癌基因bcl-2蛋白的表达。结果 牡荆苷对EC-109细胞生长、增殖具有明显的抑制作用,能够诱导EC-109细胞凋亡,且作用与牡荆苷浓度、作用时间呈正相关,可上调p53蛋白表达,下调bcl-2蛋白表达。结论 牡荆苷可能通过上调p53蛋白和下调bcl-2蛋白的表达,促进EC-109细胞凋亡,抑制EC-109细胞生长。     

金荞麦查尔酮异构酶的基因克隆及其花期表达与黄酮量分析

目的 获取金荞麦总黄酮合成途径的关键酶查尔酮异构酶（chalcone isomerase,CHI）基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦CHI基因在各组织中的表达与总黄酮量进行分析。方法 利用同源克隆技术获得金荞麦查尔酮异构酶基因（FdCHI）的cDNA序列;采用半定量RT-PCR对CHI表达量进行分析,并采用AlCl₃法测量总黄酮量。结果 金荞麦FdCHI基因cDNA包含一个750 bp的ORF,编码249个氨基酸,命名为FdCHI。生物信息学分析表明该编码蛋白与其他植物CHI氨基酸序列同源率较高。FdCHI在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花＞根＞叶＞茎,总黄酮量为花＞叶＞茎＞根。结论 在金荞麦中首次获得CHI基因的cDNA序列,编码蛋白具有CHI同源蛋白的典型特征。FdCHI基因在金荞麦茎、叶和花中的表达量与总黄酮量具有相关性,但在根中表达量与总黄酮量相关性较小。     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

UV法测定川楝子不同炮制品中总萜和东莨菪内酯的含量*

[目的]考察不同炮制方法对川楝子中有效成分的影响,为以后炮制工艺的优化提供指导。[方法]以总萜和东莨菪内酯含量为指标,采用紫外分光光度法,分别来考察不同炮制方法对川楝子中有效成分的影响。[结果]各炮制品所含总萜含量与生品比较呈下降趋势;而东莨菪内酯含量与生品比较有上升的趋势。[结论]本实验以总萜和东莨菪内酯含量作为川楝子饮片品质优劣的评定,对川楝子生品及不同工艺炮制品进行比较,在其生产与确保用药安全方面都具有实际意义。     

当归根际土壤水浸液的自毒作用研究及化感物质的鉴定

目的 通过对当归根际土壤提取液的生物学试验和有机化合物的分离鉴定,探讨当归连作障碍与自毒作用的关系。方法 设置水 (CK)、当归根际土水提液 100、125、250、500 mg/mL 共 5 个处理,用于当归自毒作用的生物学实验;气相色谱-质谱联用技术 (GC-MS) 鉴定当归根际土壤有机化合物。结果 125 mg/mL 当归根际土壤水提液能显著抑制当归自身种子发芽率、发芽指数及胚根和胚芽的伸长,且随水提液浓度的升高,这种抑制作用增强。在当归根际土壤水提液中鉴定到17个化合物,包括有机酸、酮、醛、酯和烃类等化感物质,其中很多被报道是化感物质。结论 当归根际土壤水提液对自身种子萌发和幼苗生长具有明显的自毒作用,且自毒效应具有一定的浓度依赖性,推断自毒作用可能是造成当归连作障碍的原因之一。