CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质 Gla蛋白(MGP)基因敲除的 RAW264.7巨噬细胞系,明确 MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出 3个针对 MGP基因外显子区的单链向导 RNA(gRNA)人工合成 gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的 LentiCRISPRv2质粒中,构建成 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒。将重组,质粒与 psPAX2、VSVG包装质粒一同转染 293?T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染 RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定 RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证 MGP mRNA及蛋白表达水平。 qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒,成功包装了含有 MGP?gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达 MGP的 RAW264.7细胞系。 qPCR及蛋白质印迹法检测显示,MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P＜0.05)。 qPCR结果显示,最具有代表性的 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA1细胞破骨标志分其子 Itgb3(2.29±0.17)、 Acp5(2.86±0.15)、 Ctsk(2.07±0.13)的 mRNA水平均显著上调(P＜0.05)。结论利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了 MGP基因敲除的 RAW264.7细胞系,敲除 MGP后 RAW264.7细胞破骨分化能力增强。     

补肾方骨青颗粒对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响

目的 探讨补肾方骨青颗粒对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响.方法 体外诱导破骨前体细胞系RAW264.7向破骨细胞分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞数目,图像分析计算骨吸收陷窝面积,荧光定量RT-PCR检测骨青颗粒对破骨细胞骨吸收功能标志性基因水平.结果 与对照组相比,骨青颗粒可显著抑制TRAP染色阳性细胞的产生,减少破骨细胞骨吸收陷窝的面积,明显降低破骨细胞骨吸收功能标志性基因[组织蛋白酶K(Ctsk)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)]mRNA的表达.结论 骨青颗粒可显著抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能.     

姜黄素对类风湿关节炎患者破骨细胞生成数量和活性的影响

目的 研究姜黄素对类风湿关节炎(RA)患者破骨细胞生成数量和活性的影响。方法 采集RA患者外周血,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),经核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导分化,分别采用不同浓度(2.5、5、10 μmol·L-1)姜黄素进行干预;根据姜黄素浓度将实验分为4组,即空白对照组、姜黄素低浓度组、姜黄素中浓度组和姜黄素高浓度组;14 d后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞并计数;检测细胞TRAP活性。结果 细胞培养14 d后,姜黄素低、中、高浓度组的TRAP阳性细胞计数(个/10个视野)分别为96.89±3.51、76.44±1.88和62.56±2.70,均低于空白对照组131.00±4.03(P＜0.05);各浓度组的TRAP活性(U·L-1)分别为5.74±0.36、4.21±0.12和3.06±0.07,均低于空白对照组7.48±0.22(P＜0.05)。结论 姜黄素抑制RA患者PBMCs生成破骨细胞的数量和活性,且随着姜黄素浓度的增加,抑制作用呈增强趋势。     

不同浓度破骨细胞分化因子和1,25-(OH)_2D_3体外诱导大鼠破骨样细胞形成的研究

目的研究破骨细胞分化因子和1,25-(OH)2D3共同作用对大鼠破骨样细胞体外形成的影响。方法采用大鼠脾细胞和骨细胞联合培养,实验组分别加入不同浓度的破骨细胞分化因子和1,25-(OH)2D3进行诱导,并利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝检测等方法对破骨样细胞进行鉴定,对TRAP(+)的细胞进行计数和统计学分析。统计学方法采用单因素方差分析,组间比较用SNK检验。结果各实验组细胞均有TRAP(+)多核破骨细胞出现,并在牙本质磨片上形成吸收陷窝,破骨细胞分化因子和1,25-(OH)2D3共同作用的双因子诱导TRAP(+)多核破骨细胞形成的数量要大于使用单因子诱导,且因子浓度越大,诱导效果越好。结论破骨细胞分化因子和1,25-(OH)2D3共同作用及高浓度的因子诱导可有效诱导体外破骨样细胞的形成。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白抑制小鼠破骨细胞的分化机制研究

目的：探讨鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(Carassius auratus sialyglycoproteins,Ca-SGP)对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导形成的破骨细胞的抑制作用及机制。方法：初断乳ICR雄性小鼠,无菌取股骨,分离骨髓造血细胞,通过诱导剂巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和RANKL诱导破骨细胞的分化与成熟。MTT法检测Ca-SGP对破骨细胞及其前体细胞活力的影响;通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色、TRAP检测试剂盒和骨吸收陷窝实验测定Ca-SGP在破骨细胞分化与成熟过程中的作用;实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)测定破骨细胞形成过程中核因子κB(Nuclear factor,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路关键因子的表达。结论：Ca-SGP可有效抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化及成熟,降低细胞TRAP活性及其表达,抑制骨吸收陷窝形成;分子机制方面,Ca-SGP可明显降低信号传导关键蛋白TRAP6的活性,进而抑制NF-κB和MAPKs信号通路关键因子mRNA的表达,达到抑制破骨细胞分化成熟的效果。结果：Ca-SGP可通过NF-κB和MAPKs信号通路抑制由RANKL诱导的破骨细胞形成和分化成熟。     

香叶木素通过抑制破骨细胞分化治疗早期骨关节炎的可行性研究

目的验证香叶木素治疗早期骨关节炎(OA)的可行性。方法收集人体骨关节炎软骨下骨标本,通过ACLT法手术建立小鼠骨关节炎模型,通过组织染色检测破骨细胞数量,通过显微CT检测小鼠软骨下骨结构变化。通过CCK-8法检测香叶木素对BMMs细胞的细胞毒性;通过细胞因子诱导骨髓来源巨噬细胞(BMMs)分化成破骨细胞,建立破骨细胞分化模型,并将其分为单纯诱导组及不同浓度的香叶木素诱导组;通过TRAP染色检测香叶木素对破骨细胞分化的影响;PCR法检测破骨细胞分化标记基因(TRAP,CTSK)的表达情况。结果在人体标本中,患侧软骨下骨标本中的破骨细胞数量明显少于健侧(P<0.05)。在小鼠骨关节炎模型中,术后小鼠的胫骨平台软骨下骨TRAP染色阳性的破骨细胞数量明显多于假手术组(P<0.05),小鼠膝关节软骨下骨显微CT扫描结果显示,术后的软骨下骨呈现明显的骨质疏松表现;通过CCK-8法对BMMs的活性检测,在香叶木素浓度为20μmol/L以上的处理组细胞数量较空白对照组明显减少(P<0.05),其余浓度的处理组培养至5 d仍未见明显细胞毒性;TRAP染色结果显示,成破骨细胞分化诱导7～9 d后,香叶木素(5μmol/L)诱导组TRAP染色阳性的多核细胞数量较空白对照组明显减少(P<0.05);PCR检测显示,破骨细胞分化相关基因在香叶木素(2.5μmol/L)诱导组表达水平已经明显降低(P<0.05)。结论①小鼠模型中,早期OA的软骨下骨成骨质疏松样改变,人体晚期骨关节炎软骨下骨中的破骨细胞数量明显降低;②香叶木素可以抑制破骨细胞分化。因此,推测香叶木素有望通过抑制破骨细胞分化,降低早期骨关节炎软骨下骨丢失,进而对早期骨关节炎具有一定的治疗作用。     

血清癌胚抗原相关细胞黏附分子1、骨标志物硬化蛋白、Ⅰ型前胶原氨基端延长肽及护骨素变化与绝经后骨质疏松病人骨密度变化的相关性

目的对绝经后骨质疏松( PMOP)病人血清癌胚抗原相关细胞黏附分子 1(CEACAM1)、骨标志物硬化蛋白( SOST)、 Ⅰ型前胶原氨基端延长肽( P1NP)、护骨素的变化及与骨密度的关系分析。方法回顾性分析 2015年 8月至 2016年 9月周口市中心医院收治的 90例 PMOP病人( PMOP组)、同期健康妇女 90例(对照组)。对比两组的血清 CEACAM1、SOST、P1NP及护骨素水平,及与骨密度值的关系。结果 PMOP组病人的血清 SOST(0.55±0.18)、 P1NP［( 48.62±6.74)ng/mL］及护骨素水平［(118.62±12.35)ng/mL］显著的高于对照组［(0.20±0.15)(37.30±5.26)ng/mL,(93.34±6.72)ng/mL］( t＝14.171,12.561,17.058,均 P＜0.001); CEACAM1水平显著低于对照组［(5.73±1.62)p,g/mL比( 9.60±2.50)pg/mL,t＝-12.324,P＜0.001］。 PMOP组病人的股骨颈骨密度［(0.76±0.13)g/cm2］、腰椎骨密度［(0.83±0.14)g/cm2］、股骨颈 T值( -2.51±0.50)、股骨颈 T值( -3.36±0.84)显著的低于对照组的［(0.90±0.15)g/cm2(0.96±0.18)g/cm2(-1.96±0.30)(-2.26±0.38)］(t＝-6.691,-5.408,8.948,11.319,均 P＜     

乌头碱对 H9c2细胞分化的影响

目的观察乌头碱对 H9c2细胞分化的影响。方法用不同浓度的乌头碱作用于大鼠 H9c2心肌细胞 5d后噻唑蓝比色法( MTT)检测细胞的增殖率。选取 50 μM/L的乌头碱作用于全反式维甲酸( RA)诱导分化体系下的大鼠 H9c2心肌细胞。光学显微镜观察细胞形态变化,荧光定量 PCR(qPCR)检测 actc1、myl1、myl2、tnnt2、nppb的 mRNA表达,免疫荧光细胞化学染色检测 α肌动蛋白( α?actinin)分布情况。蛋白质印迹法( Western Blot)检测 α?actinin、心肌肌钙蛋白(I cTnI)蛋白的表达。采用单因素方差分析对比组间差异。结果乌头碱能够呈剂量依赖性的抑制 H9c2心肌细胞增殖( P＜0.05)。较分化模型组,乌头碱处理组中分化细胞形态减少, actc1［(2.30±0.17)比( 0.55±0.03),F＝62.17、P＝0.000］,myl1［(2.57±0.15)比( 1.22±0.13),F＝63.15、 P＝0.000］myl2［( 18.64±0.53)(10.02±1.10)F＝206.65、P＝0.000］tnnt2［( 5.53±0.23)(2.23±0.10)F＝216.89、P＝0.000］的 mRNA表达降,低( P＜0.01)差异有统计学意义,c,TnI及 α?actinin的蛋白表,达降低。结论乌头碱能够抑制,H9c2心肌细胞分化。     

围绝经期糖代谢异常升高与骨代谢异常的相关性分析

目的分析围绝经期糖代谢异常升高与骨代谢指标的相关性,并探讨其临床意义。方法选取徐州市中心医院新城区分院 2018年 1—12月收治的围绝经期女性病人 100例,其中围绝经期糖代谢异常升高 50例为血糖异常组,围绝经期糖代谢正常 50例为血糖正常组。比较两组血糖水平、骨形成指标［骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(BGP)］、骨吸收指标［Ⅰ型胶原联蛋白羧基末端肽(CTX1)、 I型胶原氨基酸延长肽(tPINP)］、骨钙调节素(PTH)指标,并采用 pearson相关法分析血糖异常组血糖水平与骨代谢指标的相关性。结果血糖异常组的 BALP低于血糖正常组［(73.59±8.00)U/L比(96.33±12.55)U/L,t＝4.997,P＝ 0.000］,血糖异常组的 BGP［(21.06±2.19)ng/mL比(12.23±1.44)ng/mL］、 CTX1［(56.63±3.79)ng/L比(41.67±2.13)ng/L］、 tPINP［(55.76±3.78)ng/mL比(40.37±2.50)ng/mL］、 PTH［(71.60±6.34)ng/L比(44.56±3.84)ng/L］均高于血糖正常组(P＜0.05)。空腹血糖对比,血糖异常组高于血糖正常组［(9.39±1.99)mmol/L比(4.21±1.01)mmol/L,t＝24.164,P＝0.000］。血糖异常升高妇女的血糖水平与 BALP呈负相关(r＝-0.850,P＝0.000),与 BGP呈正相关(r＝0.867,P＝0.000)、与 CTX1呈正相关(r＝0.882,P＝0.000),与 tPINP呈正相关(r＝0.881,P＝0.000)、与 PTH呈正相关(r＝0.923,P＝0.000)。结论围绝经期糖代谢异常升高妇女的骨代谢指标存在一定的异常,且血糖水平异常升高可能是围绝经期妇女骨代谢异常引起骨质疏松症的重要原因。     

珊瑚共附生黄柄曲霉次级代谢产物研究

目的 研究东沙短足软珊瑚（Cladiella sp.）来源的黄柄曲霉菌（Aspergillus flavipes）中的活性次级代谢产物。方法 采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、制备HPLC等分离手段对真菌发酵液乙酸乙酯提取物进行分离,运用现代波谱技术结合文献报道数据,对化合物的结构进行鉴定;采用核因子κB受体活化因子配基（RANKL）诱导小鼠骨髓单核巨噬细胞（bone marrow macrophage cells,BMMs）分化为成熟的破骨细胞,经抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）特异性染色,对化合物抑制破骨细胞分化活性进行研究。结果 从该株真菌中分离得到4个细胞松弛素类化合物,其结构鉴定为trichalasins H,aspergilluchalasin,aspochalasin I和aspochalasin D。体外活性测试结果显示,化合物3和4可不同程度抑制BMMs向破骨细胞分化。结论 对化合物3和4抑制破骨细胞分化活性的报告是本文首次报道,对新型抗骨质疏松活性物质研究具有科学价值。