氟在体外对成骨细胞增殖能力及细胞周期的影响

目的 :建立成骨细胞体外培养模型 ,并观察不同浓度的氟对成骨细胞的影响 ,为氟中毒的机制研究提供实验依据。方法 :用幼兔肋骨培养成骨细胞 ,并纯化、鉴定。用不同浓度的氟化钠处理 (2 0 ,16 0 ,2 4 0 ,4 0 0μmol/L)成骨细胞 ,MTT法测定氟对成骨细胞增殖活性的影响 ;流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡情况。 结果 :低浓度的氟化钠 (2 0 μmol/L)在体外可显著促进成骨细胞增殖 (P <0 0 1) ,不引起成骨细胞的凋亡 ,可使S期和G2 /M期的细胞明显增多 ;高浓度的氟化钠 (16 0 ,2 4 0 ,4 0 0 μmol/L)则抑制成骨细胞的增殖 (P <0 0 1) ,引起成骨细胞的凋亡 (P <0 0 1和P <0 0 5 ) ,G2 /M期细胞明显减少。结论 :(1)成功建立了氟中毒的体外细胞模型 ;(2 )低浓度的氟化钠可以促进成骨细胞的增殖。高浓度的氟化钠抑制成骨细胞的增殖 ,诱导细胞的凋亡 ,抑制细胞由S期向G2 /M期转化。氟对成骨细胞的作用具有双向性     

不同浓度地塞米松诱导大鼠间充质干细胞向成骨细胞的分化

目的　观察不同浓度地塞米松 (DEX)诱导大鼠间充质干细胞 (MSCs)向成骨细胞分化。方法　采用原代MSCs体外培养技术 ,取大鼠后肢双侧股骨和胫骨骨髓 ,通过静置贴壁获取MSCs。以DEX、β 甘油磷酸钠和抗坏血酸作为诱导剂 ,测定诱导后细胞的MTT增殖率 ,碱性磷酸酶 (ALP)活性以及矿化结节形成能力。应用ALP染色法观察细胞形态 ,并在倒置相差显微镜下观察诱导过程中细胞形态的变化。结果　低浓度 (10 -8、10 -9、10 -10 mol/L)DEX诱导后的细胞形态由长梭形逐渐变为立方形 ,ALP表达明显升高 (P <0 .0 1)并且能够形成矿化结节 ;高浓度 (10 -6、10 -7mol/L)DEX明显抑制MSCs的增殖 (P <0 .0 1) ,抑制ALP表达 (P <0 .0 1) ,细胞形态由饱满的长梭形变为胞质宽大的扁平形 ,呈瘫痪状 ,且不能形成矿化结节。结论　低浓度DEX能够诱导大鼠MSCs向成骨细胞分化 ,而高浓度DEX抑制MSCs向成骨细胞的分化     

依普拉芬对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖和分化的影响

目的 研究依普拉芬对体外培养的原代大鼠成骨细胞增殖和分化功能的影响.方法 体外分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞,将不同浓度的依普拉芬加入培养液,测定细胞增殖情况、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节.结果 与阴性对照组相比, 各浓度组的依普拉芬均可增加成骨细胞数量(P＜0.01),提高细胞的ALP活性和促进钙化结节形成(P＜0.01),其中10-8～10-5 mol/L作用更为显著.结论 依普拉芬具有促进体外培养成骨细胞增殖、分化的作用.     

胎兔成骨细胞与复合肝细胞生长因子/异种脱蛋白松质骨的体外培养

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的胎兔成骨细胞在异种脱蛋白松质骨(DPB)支架上黏附行为及增殖和分化功能的影响.方法:成骨细胞从胎兔中分离,实验组为HGF/DPB与成骨细胞复合培养,对照组为DPB与成骨细胞常规培养.通过电镜观察成骨细胞在HGF/DPB表面生长与附着状态,同时检测细胞增殖状况和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性等,评价成骨细胞生长情况和细胞活性.结果:成骨细胞在复合肝细胞生长因子脱蛋白骨外表面及孔隙内表面均可贴附生长,增殖、分化良好.HGF/DPB对成骨细胞的ALP活性有明显的促进作用,并能促进成骨细胞的增殖.结论:HGF/DPB具有良好的生物相容性和骨诱导作用,可作为骨组织工程备选的复合支架材料.     

麦胚提取物对大鼠成骨细胞增殖分化和矿化的影响

目的　探讨麦胚提取物对骨质疏松症的防治作用。方法　体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞 ,然后用噻唑蓝 (MTT)法测定麦胚提取物对体外培养成骨细胞的增殖作用 ,氨基安替比林测酚法测成骨细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 ,茜素红染色方法 (ARS)研究对成骨细胞矿化的影响。结果　 0 10 g·L-1的麦胚提取物可以促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖和分化作用 ,0 5 0g·L-1促使成骨细胞矿化结节的形成。结论　麦胚提取物可以提高成骨细胞的增殖和分化 ,并有促进矿化的功能     

大豆异黄酮对体外原代大鼠成骨细胞增殖、分化的影响

目的 :研究大豆异黄酮对体外培养原代大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法 :采用新生大鼠颅骨分离培养成骨细胞 ,培养液中加入不同浓度的大豆异黄酮 ,以17- β 雌二醇 (E2)作为阳性对照组 ,测定细胞增殖情况、碱性磷酸酶 (ALP)活性及骨钙素 (BGP)含量。结果 :与正常对照组相比 ,大豆异黄酮可增加成骨细胞数量(P<0.01) ,提高细胞的ALP活性和BGP含量(P<0.01)。除ALP外 ,这些作用均低于E2(P<0.01)。结论 :大豆异黄酮可促进体外培养成骨细胞的增殖、分化 ,其作用与雌激素相似 ,但低于雌激素     

大黄酸-雌酮对大鼠成骨细胞增殖和分化的作用

【目的】研究大黄酸-雌酮（LC-1）对原代培养大鼠成骨细胞增殖和分化的作用。【方法】酶消化法分离培养SD乳鼠颅盖骨成骨细胞；采取MTT法测定细胞增殖，磷酸苯二钠法（pNPP）测定细胞内外碱性磷酸酶（ALP）活性，研究不同浓度LC-1对成骨细胞增殖和分化能力的影响，并与雌酚酮和大黄酸的作用进行比较。【结果】给药3d后，与空白对照组相比：10^-6mol／L LC-1组、10^-7mol／L LC-1组和10^-7mol／L雌酚酮组明显促进成骨细胞增殖和增加细胞内外ALP活性（P〈0．05）；大黄酸抑制成骨细胞增殖，其中10^-6mol／L组有明显差异（P〈0．05），同时有增加细胞ALP活性的趋势，但无统计学差异。【结论】大黄酸-雌酮在体外可以促进成骨细胞增殖和分化。     

益骨汤含药血清对成骨细胞增殖和ALP影响的实验研究

[目的]观察益骨汤含药血清对大鼠成骨细胞增殖和成骨细胞ALP的影响。[方法]取12周龄Wister大鼠40只,雌雄兼用,随机分为A、B、C、D、E五组,每组8只,分为益骨汤高、中、低剂量组(A、B、C组),a-D3对照组(D组)及NS空白对照组(E组),制备成益骨汤含药血清备用。成骨细胞建立采用新生SD乳鼠5只(24h内颅盖骨)进行体外细胞传代培养。观察益骨汤含药血清对体外培养的新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化情况。[结果]A、B、C、D组比较无显著性差异,与E组比较细胞增殖分化与ALP影响具有显著性差异(P<0.05)。[结论]益骨汤含药血清具有促进早期成骨细胞的增殖与分化。     

雌激素与流体剪切力对成骨细胞增殖和功能的间接影响

目的 :了解雌激素与流体剪切力对体外培养的成骨细胞增殖和功能的间接影响 .方法 :进行新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞原代培养 .选择恒定的雌激素浓度及合适的振荡频率分四种组合方式施加于成骨细胞 ,2 4h后用其培养液培养静止状态下的成骨细胞 ,观察不同时间段细胞增殖和碱性磷酸酶活性的变化 .结果 :经雌激素和机械力影响的条件培养液作用 12h后 ,可促进细胞增殖 (P <0 .0 1) ,该效果持续至 2 4h ,在 2 4h至 72h两因素表现为协同作用 (P <0 .0 1) ;对ALP的活性的影响在 12h之前两因素表现为拮抗作用及抑制作用 (P <0 .0 1) .2 4h后 ,机械力可促进ALP活性升高 ,并持续至 72h .结论 :雌激素和流体剪切力及两者复合作用均可通过旁分泌方式影响细胞的增殖和功能     

靶向抑制 PI3K 对PDK-1/Akt信号通路调控成骨细胞分化的影响

目的 通过观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002在成骨细胞分化过程中的影响,探讨PI3K通过调控PDK-1 /Akt信号通路对成骨细胞分化影响的分子机制。方法 采用体外培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)。通过CCK-8检测LY294002的最大安全浓度。对照组使用成骨细胞诱导培养基(OBM)处理BMSC,干预组在OBM中添加LY294002。检测两组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和细胞矿化能力,并分别采用Western-Blot和RT-PCR检测PDK-1 /Akt信号通路及下游蛋白和转录因子基因的表达水平。结果 CCK-8结果提示,在3.2 μM及以下浓度对BMSC的增殖没有影响;LY294002对成骨细胞分化的影响呈剂量依赖性（P＜0.05）;干预组ALP阳性细胞和细胞外基质矿化较对照组明显减少 (P＜0.05); Western-Blot 检测结果显示,干预组p-PDK 1和p-Akt蛋白表达水平较对照组明显降低 (P＜0.05);RT-PCR 结果提示,干预组成骨细胞相关基因ALP和骨钙素（OCN）mRNA较对照组表达明显下降 (P＜0.05)。结论 靶向抑制PI3K可通过PDK-1 /Akt信号通路明显下调成骨细胞相关基因ALP和OCN的表达,并抑制成骨细胞的分化。     

丹参对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的：了解丹参对SD大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法：取新生的SD大鼠头盖骨，胶原酶法培养成骨细胞，用MTT法来测定不同浓度丹参对体外培养成骨细胞在24、48、72h不同时段的促细胞增殖作用；采用碱性磷酸（ALP）活性观察上述药物的促细胞分化作用。结果：0．05％、0．10％、0．15％的丹参可促进成骨细胞增殖率提高（P〈0．05）；不同浓度丹参可使碱性磷酸酶（ALP）活性增强（P〈0．05）。结论：丹参具有促进成骨细胞增殖及分化的作用。     

低频正弦交变磁场磁力线方向对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响

目的研究磁场强度1.8mT、频率50Hz,正弦交变磁场磁力线方向对体外培养大鼠成骨细胞(ratsosteoblasts,ROB)的影响。方法原代培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为3组,对照组、平行组和垂直组,平行组和垂直组分别暴露在磁场中,磁场强度1.8mT、频率50Hz、磁力线方向分别与培养皿平行和垂直,30min/次/d。倒置相差显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖;第3d、6d、9d、12d测定碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性和钙盐沉积量;第10d进行ALP组织化学染色,第12d进行茜素红钙化结节染色;在正弦交变磁场(sinusoidal electromagnetic fields,SEMFs)处理0h、24h、48h和96h后,Real-time RT-PCR检测ALP、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和Osterix(OSX)mRNA表达平行变化。结果成骨细胞于磁场暴露处理3～4d后呈漩涡样分布;与对照组相比,磁场组均抑制细胞增殖(P<0.01或P<0.05),其中与垂直组比较平行组显著抑制细胞增殖;与对照组比较,磁场组均促进细胞分化成熟,表现为提高细胞的ALP活性,促进钙盐沉积量,增加钙化结节数量,提高ALP、BMP-2和OSX mRNA表达水平,尤以平行组最为明显。结论 1.8mT、50Hz,磁力线方向与培养皿平行和垂直放置的正弦交变磁场均抑制体外培养成骨细胞的增殖,但能促进其分化成熟,此作用与磁力线方向有关,尤以平行组促分化效果最为明显。     

新型多级孔生物玻璃对人成骨细胞增殖和分化的促进作用

目的：探讨一种新型的以地中海海绵为模板合成的多级孔生物玻璃（MBG）对人源性成骨样细胞系MG63增殖和分化的影响,阐明该生物活性玻璃的成骨分化作用。方法：扫描电镜观察MBG材料孔架结构;取对数生长期MG63细胞分别给予MBG浸提液（MBG组）、普通生物玻璃（NBG组）和空白培养基（空白对照组）,共培养1、3和5 d。MTT法检测各组MG63细胞的增殖率,酶联免疫法检测MG63细胞中碱性磷酸酶（ALP）的活性,实时定量PCR法检测培养24h时各组MG63细胞中成骨相关基因Sp7mRNA及Runx2mRNA的相对表达水平。结果：扫描电镜下观察,MBG为多孔支培养架结构;培养1、3和5d时MBG组MG63细胞增殖率高于空白对照组和NBG组（P<0.01）;1、3和5d时,MBG组MG63细胞中ALP活性高于空白对照组和NBG组（P<0.01）;培养24h后MBG组MG63细胞中Sp7 mRNA相对表达水平高于（P<0.01）,但Runx2 mRNA相对表达水平与空白对照组和NBG组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：与NBG比较,该新型MBG具有细胞毒性小和可促进成骨细胞分化的优势。     

感觉、运动神经匀浆对兔成骨细胞增殖与成骨功能的影响

目的 研究兔周同感觉、运动神经匀浆对兔骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞增殖与成骨能力的影响.探讨周围神经影响成骨的可能原因.方法 提取大隐神经、坐骨神经肌支分别作为感觉、运动神经组织,制备匀浆.体外培养兔骨髓间充质干细胞,常规成骨诱导后鉴定备用.以含感觉、运动神经匀浆的诱导培养基、成骨诱导培养基、无地米诱导培养基及对照培养基作用于干细胞来源的成骨细胞,观察其增殖、分化及矿化情况.结果 感觉神经组较其他各组显著促进成骨细胞增殖(P<0.01),成骨诱导组及对照组抑制细胞增殖(P≤0.001);感觉神经匀浆显著促进成骨细胞总蛋白及碱性磷酸酶(ALP)的合成(P<0.05),成骨诱导组及对照组ALP蛋白比活性显著高于运动神经组及无地米组(P<0.05);感觉神经组、成骨诱导组及对照组茜素红结合量显著高于无地米组及运动神经组(P<0.001),前三组之间无显著性差异.结论 感觉神经成分能显著促进成骨细胞的增殖、分化与矿化,运动神经成分未见促成骨作用.     

重组人甲状旁腺激素1-34促进小鼠间充质干细胞增殖及骨向分化

目的研究重组人甲状旁腺激素1-34[recombinant human parathyroid hormone1-34,rhPTH(1-34)]间断处理对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)增殖以及骨向分化的影响,进一步探讨rhPTH(1-34)促骨形成的机制。方法无菌条件下分离6～8周的C3H雄性小鼠BMSC,传代培养,10 nmol/L rhPTH(1-34)间断处理或者Vehicle处理,MTT检测细胞增殖;BMSC成骨诱导后,分别在3、6、9 d进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性测定;RT-PCR检测成骨细胞功能标志基因核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)、骨桥蛋白(osteopontin,OP)、骨钙素蛋白(osteocalcin,OC)的表达水平;Western blot检测p-Erk1/2,p-P38信号通路。结果 rhPTH(1-34)间断处理促进BMSC增殖;诱导9 d时与对照组比较,显著增加ALP活性[D(405)/D(562):(0.625±0.049)vs(0.543±0.038),(P<0.05)];显著增加成骨功能相关基因Cbfα1(增加186.6%,P<0.01),OC(增加210.5%,P<0.01),OP mRNA(增加5.5%,P<0.05)的表达水平;p-Erk1/2,p-P38水平均增加。结论 rhPTH(1-34)间断处理通过激活下游的p-Erk1/2和p-P38通路,促进BMSC增殖,增强其向成骨细胞分化,使成骨细胞数量和活性增加,从而增加骨形成达到治疗骨质疏松的目的。     

成纤维生长因子(FGF) 23基因沉默对甲状旁腺激素(PTH)促成骨细胞分化作用的影响

 目的  研究内源性成纤维生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)对甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)促成骨细胞分化作用的影响。方法  采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,应用小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术(RNAi)沉默成骨细胞FGF23表达,应用MTT法和PNPP法检测细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性,应用real-time RT-PCR法检测其FGF23、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)等基因mRNA水平,研究PTH对培养成骨细胞和FGF23基因沉默细胞的作用。结果  rhPTH1-34对培养成骨细胞增殖促进作用明显,分化促进作用弱。1×10-10~1×10-8 mol/L rhPTH1-34 作用3天,细胞增殖率增加31.6%~50.5% (P<0.05),而细胞比活性未见明显改变。同时其ALP和OCN转录水平轻度上调,分别较对照组增加35%(P<0.05)和16%(P>0.05)。rhPTH1-34上调成骨细胞FGF23 mRNA水平(4倍),该作用可被针对FGF23特异的shRNA转染所抑制。FGF23基因沉默后PTH促分化作用明显增强,其ALP和OCN mRNA水平分别较对照组增加1.8倍(P<0.05)和5.8倍(P<0.05),显示内源性FGF23对PTH促分化的干扰作用。结论  内源性FGF23可能参与PTH促分化作用的调节,FGF23上调可干扰PTH的促成骨细胞分化作用。     

Effects of dexamethasone on proliferation, differentiation and apoptosis of adult human osteoblasts in vitro

Objective To observe the effects of dexamethasone on proliferation, differentiation and apoptosis of adult human osteoblasts in vitro.Methods Iliac trabecular bone specimens were obtained from adult patients undergoing necessary surgery. After the bone pieces were digested with collagenase-trypsin, osteoblasts were released and incubated at 37℃ in a relative humidity of 95% and 5% CO2. Then, the ceils were purified, and their passages were given DMEM-F12 and fetal bovine serum medium. Subsequently, 10^8 mol/L dexamethasone was added into the culture medium to incubate the osteoblasts for three days, and the cells from control groups were incubated without any drugs. All cells were observed continually with phase contrast microscope and transmission electron microscope. Finally, apoptosis was detected by the use of terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)and biochemical indices, alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OCN) were used to determine the effects of dexamethasone on proliferation, differentiation and apoptosis of adult osteoblasts in vitro.Results In the adult osteoblasts obtained by collagenase-trypsin digestion, it achieved high survial,stable biochemical indices and excellent purification. Under the condition of dexamethasone 10^8mol/L and osteoblasts 10 000/ml, there was significant promotion of ALP and OCN secretion without cell apoptosis.Conclusions Dexamethasone has a significant effect on the proliferation and differentiation of adult osteoblasts in vitro without apoptosis, and dexamethasone at the suggested concentration can be used as positive control in drug studies for osteoporosis treatment.     

重组人甲状旁腺激素(1-34)对体外培养成骨细胞骨形成的作用

目的 体外观察重组人甲状旁腺激素[recombinant human parathyroid hormone（1-34），rhPTH（1-34）]对成骨细胞骨形成的刺激作用。方法采用酶消化法分离获得大鼠成骨细胞，间隙加药方法给予rhPTH（1-34），观察药物对成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响。结果 10^-12～10^-8mol／L浓度对成骨细胞的增殖、分化和矿化功能均显示刺激作用。10^-11～10^-8mol／L浓度组的MTT、ALP的A值及矿化结节形态计量结果与对照组比较，具有显著性增加（P〈0．05），增加率以10^-9mol／L浓度组为最高，并呈剂量一效应关系。结论 rhPTH（1-34）对体外培养成骨细胞的增殖、分化和矿化功能具有明显促进作用。