结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因,酶切,克隆至PGEM-TEasy质粒,测序确定插入片段的正确性,再克隆至表达载体pET30a中,并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导,表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因,构建了重组表达质粒,得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,纯度〉90%。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白,可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因，酶切，克隆至PGEM—TEasy质粒，测序确定插入片段的正确性．再克隆至表达载体pET30a中，并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导，表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因，构建了重组表达质粒，得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，纯度〉90％。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白，可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础．     

结核分枝杆菌Rv1884基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的　克隆表达结核分枝杆菌Rv1884基因 ,序列测定正确后进行融合表达、纯化。方法　采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1884编码基因 ,用限制性内切酶消化后插入到pGEM Teasy中 ,序列测定正确后 ,再亚克隆到融合表达载体 pPro EXHT中 ,转化大肠杆菌DH5α ,目的基因经IPTG诱导 ,由T7启动子调控表达了氨基端带 6个连续组氨酸残基的Rv1884蛋白 ,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果　获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1884蛋白基因 ,得到融合 6个组氨酸残基的Rv1884蛋白纯度大于 85 %。结论　构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的重组表达载体 ,并获得了高纯度的融合表达蛋白 ,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因的重组质粒构建及蛋白表达

目的应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c所编码蛋白的结构特征,并对其进行克隆和表达。方法利用Bioedit、Dnaman及Pfam等对Rv1246c和Rv1247c所表达蛋白结构进行分析;以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板,用PCR分别扩增Rv1246c和Rv1247c基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DH3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE及Western-blot免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。结果生物信息学分析表明它们与大肠杆菌的relBE家族有相似的蛋白模块,Rv1246c蛋白与大肠杆菌RelE同源性是21.55%,Rv1247c同源性是23.85%;两个重组质粒构建成功;通过SDS-PAGE检测分别在31kD和29kD处有特异性条带;Western-blot免疫印迹出现特异性阳性信号;间接ELISA检测多克隆抗体效价均大于1:40 000。结论本研究首次成功构建了结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了Rv1246c和Rv1247c蛋白,为进一步研究该组基因的分子功能奠定了良好基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌HSP65与IL-2融合蛋白的表达和纯化

目的获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础。方法用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序,将测序正确的目的基因片段分别经EcoRI和ClaI,ClaI和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EX HTa,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,经IPTG诱导后进行融合表达,并通过镍柱对融合蛋白进行纯化。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,在Mr 78000处有特异性的蛋白表达条带。用镍柱进行亲和层析纯化后得到了高纯度的HSP65-IL-2融合蛋白。结论成功的构建了结核分枝杆菌HSP65与人IL-2的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,有望为结核的预防提供有效的疫苗。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21 (Culture filtrate protein 21, CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR 扩增cfp21基因,质粒PET28a ( + )为表达载体,构建PET28a（+）/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS PAGE分析,并用His Bind 蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因，并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后，经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得重组Rv3873蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。