TK基因重组质粒的构建及在ACC-2细胞中的表达

目的：克隆胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因，构建质粒表达载体pIRES—TK，并利用该载体转染ACC-2细胞，建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞克隆。方法：通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX—TK中扩增出TK基因全长序列，将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中，构建重组表达载体pIRES—TK，用电穿孔法以该质粒转染ACC-2细胞，经G418筛选获得稳定表达TK基因的ACC-2细胞株，提取该细胞株的总RNA，用RT—PCR检测TK基因的表达。结果：PCR扩增出1128 bp大小的片段，测序结果与GeneBank报道的TK序列基本一致；阳性重组质粒pIRES—TK经XhoI和Mull双酶切后获得2692 Bb和1128 bp的片段；RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出361 bp的预期片段。结论：成功扩增了TK基因的DNA片段；成功构建了质粒表达载体pIRES—TK；建立了稳定表达TK基因的ACC～2细胞株，为TK／GCV自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定良好的基础。     

VEGF165真核表达载体的构建与体外表达

目的:体外构建血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165的荧光真核表达载体,并检测其在293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从人单核细胞白血病细胞株THP-1中分离、扩增目的片段,单酶切克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构成重组质粒pEGFP-VEGF165,测序验证。通过脂质体介导质粒瞬时转染293T细胞,RT-PCR和免疫细胞化学检测VEGF165的表达。结果:通过RT-PCR获得576bp的cDNA片段,测序结果与基因库(Genbank)中序列完全一致。转染后经RT-PCR和免疫细胞化学检测证实转染重组质粒组有VEGF165蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到VEGF的表达。结论:本研究构建了人VEGF165荧光真核表达载体pEGFP-VEGF165,并能成功地在293T细胞中表达。     

促凋亡分子Bad真核表达载体构建及其在人基底细胞癌细胞中的表达

目的:克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad的全长编码序列,构建Bad基因的真核表达载体并在人基底细胞癌细胞系(A431)中表达,为研究该基因在人基底细胞癌治疗中的作用奠定基础。方法:根据已发表的Bad基因的核苷酸序列设计并合成引物,用Hela细胞抽提的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用XhoI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.1-myc-Bad并对其DNA测定序列。用脂质体法将pcDNA3.1-myc-Bad导入人基底细胞癌细胞系A431中,G418选择培养,Western blot及SABC-FITC分析鉴定其表达。瞬时转染A431细胞,通过细胞计数和集落形成实验观察其对A431细胞生长的影响。结果:RT-PCR扩增出长500bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.1-myc后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pcDNA3.1-myc-Bad在A431细胞中有表达并可影响细胞生长,与对照组有明显差异。结论:成功克隆了Bad的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad,并在瞬时转染肿瘤细胞后观察到细胞生长受抑制。     

BimS慢病毒RNA干扰载体的构建及其感染效率和干扰效果的实验研究

目的:应用RNA干扰技术构建BimS慢病毒RNA干扰载体,探讨其感染效率和干扰效果.方法:针对人BimS设计3个干扰靶点,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体中.将重组质粒进行病毒包装、并且通过感染ACC-2细胞观察其感染效率,定量PCR检测其对BimS mRNA干扰效果.结果:PCR产物经扩增电泳后阳性克隆得到337bp条带,插入序列片段与DNA测序结果完全相符.重组慢病毒载体在293T细胞中包装获得滴度为2×10s TU/ml的病毒颗粒,MOI=20,转染效率为85％.转染pFU-GV-BmS-1组、pFU-GV-BmS-2组及对照组BmS mRNA相对表达水平分别为:0.743±0.025、0.466±0.023、1.266±0.042(组间两两比较,P＜0.05).结论:BimS慢病毒RNA干扰载体构建成功,并能高效感染ACC-2细胞及下调BmS mRNA表达.     

小鼠Dlx-5 cDNA的克隆及序列测定

目的 :扩增小鼠Dlx 5的特异性片段 ,构建重组质粒并进行序列测定 ,为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础。方法 :提取E14d小鼠的下颌弓组织总RNA ,以反转录cDNA为模板进行PCR反应 ,克隆Dlx 5至PMD 18T载体上并测序。结果 :从胎鼠下颌弓组织中克隆到Dlx 5基因片段约 869bp ,重组质粒经酶切显示获得正确重组子 ,测序结果与已知序列吻合。结论 :成功地从小鼠下颌弓中克隆到了Dlx 5基因 ,提示胎鼠的下颌弓组织中有Dlx 5基因的表达。     

靶向黏着斑激酶siRNA表达载体构建及转染Tca8113细胞的沉默效应

目的:构建靶向黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用.方法:根据siRNA的设计原则,在人FAK mRNA序列中,设计并合成2条特异性靶序列寡核苷酸及2条无关对照序列,经退火成互补双链,再克隆到pGC-silencerTM-U6/Neo真核表达载体中,构建重组体pSilencer-FAK并进行酶切鉴定;转染重组质粒至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用免疫细胞化学和Westem-blot鉴定FAK的沉默效应.结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;psi-lencer-FAK转染细胞后,FAK基因的表达受到明显抑制.结论:成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制细胞中FAK的表达.     

BimS真核质粒过表达载体构建及诱导ACC-2细胞凋亡作用

目的 构建BimS真核质粒过表达载体及鉴定并转染ACC-2细胞,观察其在细胞中上调BimS蛋白表达及促凋亡作用.方法 根据人BimS基因设计引物,扩增目的基因片段,挑选阳性克隆,分别采用PCR扩增电泳和DNA测序鉴定.分为对照组和实验组将构建的质粒表达载体转染ACC-2细胞,通过定量PCR和Western biot检测其基因和蛋白相对表达水平,检测细胞凋亡率和超微结构的变化.结果 实验组细胞凋亡明显,凋亡率为(29.6±0.3)％;对照组细胞凋亡率仅为(0.83±0.2)％,实验组与对照组细胞凋亡率比较具有统计学差异(Pp＜0.05).电镜下实验组细胞呈典型的细胞凋亡形态学改变,对照组细胞形态未发生变化.结论 BimS真核质粒过表达载体构建成功,并能显著上调ACC-2细胞中BimS mRNA、蛋白表达及诱导细胞凋亡.     

人成釉蛋白编码区cDNA的克隆和N端肽的融合表达

目的 :克隆人成釉蛋白 (Ameloblastin)编码区基因并原核表达其N端肽。方法 :抽提人牙胚总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成人牙胚cDNAs,然后利用PCR方法 ,从cDNAs中扩增出人成釉蛋白编码区cDNA序列 ,将所得基因片段插入 pGEM -TEasy质粒载体 ,转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列测定鉴定阳性克隆。将所克隆序列的 5’端 5 5 8bp的片段连入原核表达载体 pGEX - 4T1并在大肠杆菌中诱导表达 ,SDS -PAGE分析。 结果 :克隆片段测序结果与GenBank数据库收录的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 4 6× 10 3 的融合蛋白。结论 :克隆到人成釉蛋白编码区cDNA ,并在大肠杆菌中表达了人成釉蛋白N端肽     

CD-TK双自杀基因系统对腺样囊性癌ACC-2细胞放疗增敏的作用

目的:探讨前体药物及CD-TK双自杀基因系统对人腺样囊性癌(ACC-2)细胞的放疗增敏作用.方法:重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK经电穿孔法共转染ACC-2细胞,以400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD及TK基因的ACC-2细胞,提取该细胞的总RNA,RT-PCR检测CD、TK基因的表达:将阳性克隆的ACC-2细胞分别在有氧及乏氧条件下给予不同剂量(0、2,4、6、8、10Gy)X线照射及前体药物干预,通过细胞克隆形成实验,观察双自杀基因及前体药物在有氧及乏氧条件下对ACG-2细胞的放疗增敏作用.采用SPSSll.5软件包对数据进行多因素方差分析.结果:RT-PCR检测到ACC-2/CD-TK中CD、TK基因的表达;随X线照射剂量的增加.各组细胞放疗后克隆形成率均明显降低;有氧条件下,X线照射ACC-2/CD-TK+前体药物组细胞存活分数均较相同剂量X线照射ACC-2及ACC-2/CD-TK细胞组低(P＜0.05);乏氧条件下.X线照射ACC-2/CD-TK+前体药物组细胞存活分数均较相同剂量X线照射ACC-2及ACG-2/CD-TK细胞组低(P＜0.05);相同照射剂量下,各相应细胞组在有氧条件下细胞存活分数较乏氧条件下低.结论:CD-TK双自杀基因及其前体药物的应用.可以提高ACC-2细胞放疗敏感性及X线放射治疗对ACC-2细胞的杀伤作用.     

骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用.方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插人到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4).用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致.干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Westerm印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果.为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建.结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致.转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想.通过测序结果比对,插入序列完全正确.pLenti-mi-VHL构建成功.结论:成功构建了BMSCS的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础.