用M13噬菌体P H蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达HIV-1 gp41抗原表位

目的：探讨M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达融合蛋白的可行性.方法：以纯化的HIV-1感染者血清多克隆抗体为配体,在噬菌体展示随机十二肽库中进行生物淘洗,经ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序,确定优势表位.将优势表位及两个优势表位的串联体分别与M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域连接,克隆入PQE30载体进行蛋白表达,再以表达蛋白为抗原检测HIV-1感染者血清中的抗体.结果：成功筛选到位于HIV-1 gp41蛋白上的3组优势抗原表位（HGPKDAETTAIW;AAFKDNQLLRIW;AAFKDNQLTRIW）,3组优势表位及表位串联体（YGPKDAETTAIW-GGGS-SCSAKFTCTTQI）在PQE30载体中实现可溶性融合表达.重组蛋白具有良好的抗原性,能与不同的HIV-1抗体阳性血清呈特异反应.结论：用M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达HIV-1 gp41抗原表位是可行的.     

巨细胞病毒gp52蛋白表达与应用

目的 构建表达巨细胞病毒(CMV)gp52蛋白抗原的重组质粒及工程菌,获取纯化的gp52蛋白抗原.方法 采用PCR技术,克隆表达CMV gp52重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定其抗原性及实用性.结果 表达纯化的gp52蛋白纯度＞95%,经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测35份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和35份阴性血清,用酶标记gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率97.1%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,差异无统计学意义(P＞0.05);其中1份CMV-IgM阳性血清1:16稀释后仍能与抗原反应,表明gp52蛋白抗原表位有较好的抗原特异性.结论 高效表达纯化的gp52蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测巨细胞病毒抗体.     

幽门螺杆菌基因克隆表达及其抗原表位分析

目的 克隆表达幽门螺杆菌基因hp0410,构建12肽噬菌体展示库,对hp0410的抗原表位进行筛选和分析,为构建多表位嵌合疫苗提供理论依据.方法 从幽门螺杆菌NCTC11639基因组DNA中扩增出hp0410,并克隆入pGEX-4T-1中表达.利用纯化重组蛋白筛选出特异性单抗E018,利用该单抗和M13噬菌体12肽随机肽库,构建HP0410抗原表位的抗原展示库.竞争-抑制实验验证获得的阳性噬菌体并测序,生物信息学分析HP0410的抗原表位.结果 成功构建可高水平分泌型表达HP0410的原核表达系统.对13株阳性噬菌体测序后获得8个表位,其中候选表位1个.HP0410可有效抑制展示该表位的噬菌体与单抗E018结合.分析表明,获得的8个表位与HP0410同源性不高,但处于生物信息学预测的区域.结果 获得8个HP0410高抗原性区域的模拟表位,其中1个为模拟单抗E018特异性结合的抗原决定基的候选表位.     

应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体

目的利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆。其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1～20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml。结论从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测。     

噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究

目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸。以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pgml,检测下限为150pgml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。     

随机肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位及其应用

目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阴断,模拟表位的共有序列为:异亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—蛋氨酸—缬氨酸—X—X,X为任意氨基酸。以其中阻亲和力最强的克隆(P2)建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200~8000pg/ml,检测下限为150pg/ml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。     

Ⅰ型登革病毒prM抗体的制备及初步鉴定

目的以Ⅰ型登革病毒pr M蛋白为靶抗原,制备相应的多克隆和单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法 RTPCR扩增Ⅰ型登革病毒全长pr M基因,转入克隆载体和构建重组表达载体,以原核表达及纯化后的pr M蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,采集免疫兔血清,制备抗pr M蛋白多克隆抗体;取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选阳性克隆,获得特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备抗pr M蛋白单克隆抗体,应用亲和层析法纯化抗体,Western-blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。结果获得全长pr M的多克隆抗体及1株能稳定分泌抗pr M蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体的效价高,特异性好。结论制备了Ⅰ型登革病毒pr M多克隆抗体和1株单克隆抗体,为进一步探讨登革病毒pr M抗体依赖的感染增强作用奠定基础。     

BED-CEIA估计HIV-1新近感染率的有效性及其影响因素的评价

在艾滋病流行病学研究中,衡量艾滋病流行趋势最常用的指标是HIV累积感染率和新近感染率.与累积感染率相比,新近感染率对艾滋病流行趋势预测、干预效果评价以及防制策略的制定等能提供更直接的信息.在获取新近感染率的方法中,除了经典的流行病学队列随访方法,目前普遍使用的血清学方法之一是IgG捕获BED酶联免疫法(BED-CEIA).2001年,美国疾病预防控制中心(CDC)艾滋病免疫和诊断室评估了16种基于不同抗体和原理的HIV-1新近感染检测方法,发现新近感染者与既往感染者相比,各种抗体滴度均较低;其中gp41抗体滴度在新近感染者和既往感染者中的差别最大,两者的滴度区间几乎没有重叠,新近感染者的gp41抗体亲和力低于既往感染者,从而认为gp41抗体能够区分新近感染者和既往感染者,并且酶联免疫实验操作相对简单、效果也较理想,因此该室着手开发基于gp41抗体的HIV-1新近感染检测的酶联免疫方法[1].     

HIV新发感染者1型抗体蛋白印迹带型分析

目的分析HIV-1抗体阳性新发感染者和长期感染者蛋白印迹带型变化,探讨它们的带型分布特征。方法对2014-2016年湛江市HIV-1抗体阳性的男男人群进行新发感染检测,确定新发感染组和长期感染组,对两组的蛋白印迹带型进行统计分析。结果膜蛋白gp41、gp120、gp160、酶蛋白p66和核心蛋白p24阳性率最高(总阳性率分别为94.7%、100.0%、100.0%、96.0%、100.0%),其次是酶蛋白p31、p51(总阳性率分别为84.0%、85.3%),核心蛋白p17(52.0%)和前体蛋白p55(24.0%)最低;新发感染者各带型阳性率总体上比长期感染者低,具体是膜蛋白gp120、gp160和核心蛋白p24始终保持100.0%阳性率,酶蛋白p66稍有下降(100.0%降到94.7%),而其它带型阳性率均有不同程度升高,且各带型在新发感染和长期感染中差异没有统计学意义(P0.05);新发感染者缺失p17+p55(61.1%)比长期感染者(36.8%)要高很多(P=0.070)。结论带型p17+p55的缺失可能提示为新发感染者(P=0.070),待继续收集资料进一步阐明。     

重组表达HIV不同亚型gp41蛋白的抗原表位暴露情况分析

目的通过化学发光法检测原核重组HIV I型4种不同亚型gp41膜外区蛋白对阴阳性标本的反应性,间接反映重组表达gp41膜外区蛋白的抗原表位暴露情况,为科研、临床异常标本分析提供分析方法。方法选取HIV I型4个国内主流基因型(BC、AE、B、C)膜外区序列,克隆至pGEX4T-3载体中,优化目标蛋白的纯化工艺,制备出HIV I型gp41膜外区相应蛋白作为包被抗原,与商品化gp41-HRP酶结合物配对后,夹心法进行HIV I型阴阳性标本反应性的测试,从而判断相应蛋白抗原表位暴露情况。结果HIV I型4个亚型的gp41膜外区相同区段在pGEX4T-3原核载体中均能表达出符合预期大小的目的蛋白;纯化后分别作为包被抗原,按相同浓度包被后进行HIV I型阴阳性标本的测试,结果显示不同亚型的gp41表达蛋白与商品化gp41-HRP酶反应性存在较大差异。结论通过原核表达系统高效表达了HIV I型主流亚型gp41膜外区蛋白,化学发光法组建夹心法进行阴阳性标本测试,其反应性不一致,间接反映出不同基因型选取同一表达区域进行体外重组表达其结构折叠方式有区别,此研究为HIV科研、临床标本验证等提供了基础。     

2013年江西省新报告HIV-1感染者新发感染检测状况及其免疫印迹条带特征分析

摘要:目的　分析2013年江西省新报告HIV-1感染者新发感染检测状况及其免疫印迹条带特征。方法　应用BED-CEIA法对2013年新报告HIV-1感染者中符合新发感染检测要求的样本进行检测。结果　符合新发感染检测要求的852名HIV-1感染者,检出新发感染者206名,长期感染者646名,BED-CEIA新发感染检测判定为长期感染和新发感染的HIV-1感染者在婚姻、文化程度和感染途径上差异有统计学意义（P＜0.05）。新发感染者WB检测条带中p66、p55、p51、gp41、p39和p31的阳性检出率显著低于长期感染者（P＜0.05）。结论　WB检测结果缺失p51和gp41时应高度怀疑其为HIV-1新发感染。     

2020-2021年河北省新诊断HIV-1感染者中和抗体分布状况

目的 了解河北省2020-2021年新诊断HIV-1感染者不同人群中和抗体分布特征及潜在的影响因素。方法 收集河北省2020年-2021年新诊断的HIV-1感染者血浆共500份，中和实验筛查感染者血浆中和抗体分布，PCR扩增和测序获得感染者体内毒株env基因序列，分析gp120的V1V2区、V3区和gp41基因氨基酸序列长度及非同义突变与同义突变的比例(dN/dS)所体现的选择压力与感染者血浆中和广度的相关性。结果 相较于异性恋感染者，男男同性恋感染者群体中和抗体滴度更高，异性恋感染者群体中，男性感染者的中和抗体滴度高于女性感染者；CRF01＿AE和BC重组型感染者血浆样本对同亚型假病毒表现出更强的中和活性(P均<0.05),而单纯B亚型和C亚型毒株感染者血浆样本对同亚型假病毒或不同亚型假病毒的中和活性均无统计学差异；gp120的V1V2区的氨基酸序列长度及体现选择压力的dN/dS均与中和抗体的中和广度线性相关。结论 HIV-1感染者体内中和抗体在不同传播人群分布存在差异，男男同性恋感染者人群比异性恋人群具有更高的中和活性，重组型感染者血浆展现出对同亚型假病毒的中和优势；且中和抗...     

肺吸虫模拟抗原诊断价值及序列分析

目的　探讨噬菌体展示肺吸虫模拟抗原的诊断价值并分析与天然抗原的同源性。方法　建立肺吸虫噬菌体模拟抗原的ELISA ,对肺吸虫病人、日本血吸虫病人、旋毛虫病人及健康者血清进行检测 ,分析其敏感性和特异性 ;提纯噬菌体模拟肽的DNA模板进行序列测定 ,以Blast软件分析其序列同源性。结果　肺吸虫模拟抗原的 6个阳性克隆中P5、P6、P8、P13、P16的阳性、阴性预测值及诊断效率均为 10 0 % ,P7的阳性、阴性预测值及诊断效率分别为 10 0 %、78.9%、86.7%。上述 6个克隆有 2个克隆的DNA序列完全相同 ,即 6个克隆包含了 5种不同的抗原表位 ;Blast分析表明 5个表位与已知的肺吸虫抗原表位无DNA序列的同源性。结论　肺吸虫模拟抗原对肺吸虫病具有一定的诊断价值 ,这 5种表位可能从空间结构上模拟了天然抗原表位。     

人源抗HIV-1V3环噬菌体抗体筛选与鉴定

目的 以人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gp120 V3环的合成环肽为抗原,从人的噬菌体抗体组合文库中筛选出与抗HIV-1 V3肽有结合活性的人源噬菌体抗体(Fab段).方法 用噬菌体抗体库技术筛选人源抗HIV-1V3环噬菌体抗体,ELISA测定其活性,竞争抑制实验证实了该噬菌体抗体的特异性.结果 序列分析表明.重链基因为IgG1亚类,可变区属VHI亚群.与胚系基因DP-88同源性最高,D区为D3-3、J区为JH5;轻链为k亚型.可变区属VL IV亚群,D区为DPK22,J链为Jk4胚系.结论 成功筛选了人源抗HIV-1 V3环噬菌体抗体.其具有很好的生物学活性和特异性.     

HIV-1B''特异性细胞毒性T细胞与疾病进展关系

目的 了解人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIv-1)B'亚型特异性细胞毒性T细胞(CTL)功能与中国HIV-1感染者疾病进展关系.方法 将覆盖HIV-1B亚型Gag p17、p24和p2p7p1p6全长的54个重叠多肽作为抗原,用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测58例HIV-1感染者特异性CTL对上述多肽的应答情况.结果 中国HIV-1感染者特异性CTL可识别多个HIV-1B'Gag表位,反应宽度与病毒载量显著负相关(r=-0.374,P=0.004),与CD4 T细胞绝对计数显著正相关(r=0.425,P=0.001),反应强度与病毒载量显著负相关(r=-0.285,P=0.030).长期不进展者识别 HIV-1B'Gag多肽的反应宽度显著高于无症状感染者和艾滋病患者(P=0.001,P=0.005).结论 我国HIV-1感染者体内存在识别不同HIV-1B'Gag多肽表位的特异性CTL应答,并且与疾病进展相关.     

HIV感染者窗口期的实验诊断

目的筛查高危人群和一般人群中HIV窗口期感染者,并评估各实验方法的检测性能。方法使用第四代抗原/抗体联合检测,HIV-1P24抗原检测,以50:1、10:1、1:1三级集合HIV RNA RT-PCR和流式细胞术对1383例高危人群和2249例一般人群血清进行筛查。结果分别自高危人群和一般人群中筛查出1例HIV窗口期感染者,其中高危人群中的1例抗体和P24抗原检测均为阳性,病毒载量HIV-1RNA拷贝每毫升为51万,并且CD4+/CD8+T细胞的比值小于0.9;在一般人群中所发现的1例P24抗原检测为阳性,HIV-1RNA拷贝数为每毫米32万,CD4+/CD8+T细胞比值0.92,追踪采样抗体检测结果为前阳后阴再阳。结论①第四代抗原/抗体联合检测,病毒载量HIV-1RNAP24抗原和流式细胞术检测具有良好的实验性能,可用于HIV感染者窗口期筛查。②关注第二窗口期的出现。     

新型隐球菌Cap10蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:重组表达新型隐球菌Cap10蛋白并制备特异抗体,为新型隐球菌的检测和诊断提供特异抗原和抗体。方法:选择CAP10基因开放阅读框架(ORF)抗原表位集中、保守性高的片段,经过大肠杆菌偏嗜的密码子优化后进行基因合成,将目的片段克隆至原核表达载体pQE30中构建重组蛋白表达载体pQE30-CAP10并鉴定,IPTG诱导重组蛋白在M15中表达,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定;镍柱纯化后,免疫家兔制备抗血清。结果:在大肠杆菌中成功表达Cap10,其纯度大于95%;二免后家兔血清抗体效价达到200万以上。结论:获得了高纯度的Cap10蛋白及高效价的多克隆抗体,为新型隐球菌的检测和致病机制研究奠定了基础。     

抗人巨细胞病毒重组抗原gp52单克隆抗体的研制及应用研究

目的 :为了获得抗人巨细胞病毒 (HCMV)单克隆抗体 (McAb) ,并将其用于人HCMV感染后的抗体检测。方法 :采用杂交瘤技术获得抗重组HCMV(rhCMV)gp 5 2蛋白的McAb。并用抗人 μ链抗体包被、rhCMVgp5 2蛋白作抗原和HRP -McAb作标记抗体 ,建立了检测抗HCMV抗体的捕获ELISA。用该法检测献血员、病毒性肝炎患者及疑似CMV感染的肝炎综合征患者血清共计 939份。结果 :最终获得 4株 (3E9,5A6 ,4G1 2 ,2H2 )能稳定分泌高效价抗rhCMVMcAb的杂交瘤细胞。它们分别识别gp5 2蛋白上的 2个不同抗原表位 ,2H2识别gp5 2蛋白上的一个表位 ,3E9,5A6和 4G1 2则共同识别另一个表位。用其建立的捕获ELISA ,gp5 2蛋白抗原最佳浓度为1 μg·mL- 1,酶标单抗的工作浓度为 1 :1 6 0 0 ,批内平均变异系数 3.7% ,批间平均变异系数 7.9%。6 34例献血员IgM抗体阳性 1 7例 (2 .7% ) ;2 88例病毒性肝炎患者 ,阳性 1 0例 (3.5 % ) ;1 7例肝炎综合征患者 ,阳性 1 1例 (6 4.7% )。均经免疫印迹法证实。结论 :用gp5 2蛋白及其单抗建立的捕获ELISA ,特异性强 ,灵敏度高 ,不受类风湿因子的影响 ,结果可靠 ,优于全病毒抗原构成的检测试剂 ,适用于临床诊断和流行病学调查     

SARS冠状病毒多抗原表位融合蛋白的表达及其诊断应用

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)多抗原表位融合蛋白,建立一种可特异性诊断SARS的血清学方法,用于SARS的明确诊断和流行病学调查研究.方法 设计含有SARS冠状病毒S、M和N蛋白优势抗原表位区的多表位融合蛋白SMN,利用大肠杆菌表达SMN蛋白,并作为包被抗原建立ELISA方法,用于SARS患者血清检测.结果 设计出包含S603-635 M2-31、N362-412表位区的多表位融合蛋白SMN,并在大肠杆菌中成功表达.以SMN蛋白为包被抗原,ELISA检测74份SARS患者血清全部为阳性,另44份非SARS-CoV感染的发热病人血清和62份健康人血清均为阴性.结论 SARS-CoV多抗原表位融合蛋白SMN在大肠杆菌中成功表达,以SMN为检测抗原建立的ELISA方法为SARS血清学诊断奠定了基础.     

噬菌体抗体库技术的发展及未来

噬菌体表面展示技术是近年发展起来的 ,将外源蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面融合表达的新技术。应用PCR技术从生物体内扩增出整套抗体轻、重链可变区基因 ,克隆到λ噬菌体表达系统 ,构建噬菌体抗体库 ,通过抗原亲和吸附 -洗脱 -增殖 ,从中筛选富集多种目的克隆 ,制备相应单克隆抗体。