抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

CEA单抗轻重链可变区基因的克隆和序列分析

从分泌具有高亲和力和特异性的小鼠抗癌胚抗原（ＣＥＡ）的单抗杂交瘤细胞株Ｃ５０中提取总ＲＮＡ，通过ＲＴＰＣＲ扩增并克隆了抗体的轻、重链可变区基因。核苷酸序列分析表明所克隆基因分别为抗体轻、重链可变区基因。     

抗人CD154单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:克隆抗人CD154抗体轻重链可变区基因,并分析其核苷酸序列,为基因工程抗体的构建奠定基础。方法:从分泌能抑制免疫反应的抗人CD154单克隆抗体杂交瘤细胞株 7E8中提取总RNA,合成cDNA第一链后,经PCR扩增获得抗人CD154单抗轻链可变区 (VL)和重链可变区 (VH)基因,分别克隆入pUC18载体,并进行序列分析。结果:①抗体的轻链可变区基因全长为 341bp,编码113个氨基酸,归属于Ig的Vκ2基因,氨基酸序列分析结果显示轻链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3位和第 93位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸;②抗体的重链可变区基因全长为 354bp,编码118个氨基酸,归属于小鼠IgVH基因,D、J区基因分别属于DSP2.9和JH2,氨基酸序列分析结果显示,重链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3和第 97位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别为抗体的轻、重链可变区基因.     

抗bFGF McAb制备,鉴定及轻链可变区基因克隆和序列析

目的：以重组人碱性成纤包生长因子为抗原免疫小鼠,建立多株稳定分泌ｂＦＧＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。半对ｂＦＧＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因进行扩增及序列分析。方法：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法和免疫沉淀法对抗体特异性和ｌｇ类型进行鉴定,同时,应用分子生物学技术,对Ｖｋ基因的ＤＮＡ片段进行克隆,并对４ａ２Ｖｋ基因进行序列测定。结果：ｂＦＧＦ单克隆抗体可特异性结合人重组ｂＦＧＦ抗原,且     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备

作者用提纯的解脲脲原体抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞FO融合,获得3株稳定分泌抗解脲脲原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体,并对杂交瘤细胞株进行了鉴定。用ELISA法测定该抗体腹水效价为1:64000～1:2048000,1F9、2B2抗体的Ig类型为IgG1,5H1为IgG2b。建立的3株能稳定分泌抗解脲脲原体的McAb杂交瘤细胞林,经液氮冻存后复苏,其分泌抗体能力不受影响。     

登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础。方法应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结果从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母（Pichia Pastoris-NS1）中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8000～1∶16000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结论成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法。     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

Annexin A2单克隆抗体制备及初步鉴定

制备Annexin A2特异性单克隆抗体(McAb),为Annexin A2的体内外功能的研究提供有力的抗体工具。以原核表达的全长p36蛋白(Annexin A2单体)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对Annexin A2的McAb。以间接ELISA法筛选出目的杂交瘤细胞株并进行染色体计数;分析McAb的亚型,检测其效价、浓度及亲和常数;以细胞荧光染色,Western blot和RT-PCR鉴定McAb特异性。结果得到1株能稳定分泌特异性针对p36的McAb的细胞株F8,其抗体亚类重链为IgG2a,轻链为κ型;腹水纯化后效价为1∶4 000;亲和常数为3.4×109L/mol。成功获得了能稳定分泌AnnexinA2特异性McAb的细胞株。     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白特异性单克隆抗体(McAb)，为SARS的快速诊断及致病机制的研究提供实验材料。方法 用纯化的重组SARS-CoVN蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合和亚克隆后获得分泌针对N蛋白的杂交瘤细胞株，用Western blot和间接免疫荧光法检测这些细胞株分泌的单克隆抗体特异性，并将N蛋白分3段表达初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。结果 通过细胞融合和3轮克隆化，筛选出分泌抗N蛋白的6个杂交瘤细胞株。Western blot及免疫荧光显示，获得的McAb可与SARS-CoVN蛋白及SARS-CoV发生特异性反应，有4个细胞株分泌的抗体的识别位点位于N蛋白N端，2个位于C端。结论 获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体并进行了初步定位，可用于SARS的早期诊断及致病机制研究。     

重组人α干扰素单克隆抗体的研制及其应用

目的　研制抗干扰素的单克隆抗体 (McAb)及其应用。方法　应用杂交瘤技术 ,获得 4 0株抗重组人α干扰素的单克隆抗体细胞株 ;用ELISA方法检测腹水滴度 ,用辛酸法纯化McAb。结果　 4 0株细胞中 2E9、4G1能稳定分泌抗重组人α1b干扰素的单克隆抗体 ,2C9为抗重组新型干扰素 ,2A7、4G10分泌抗重组人α干扰素 (α1b、α2b、α2a、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素的单克隆抗体细胞系 ;体外连续传代 6个月 ,分泌抗体能力不变 ,特异性专一。 5株单克隆抗体均为IgG。采用辛酸方法提纯抗体纯度达到 95 %以上。粗制的重组人α干扰素经 4G10单克隆抗体亲和层析柱提纯后 ,获得的干扰素纯度 95 %以上 ,平均收率 93% ,残余鼠IgG含量 <10 0ng 剂量 (5 0 μg)。 2C9单克隆抗体亲和层析柱适用于纯化新型干扰素。结论　 4G10单克隆抗体亲和层析柱可以应用于大规模重组人α干扰素生产。     

抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1抗体可变区基因克隆、串联和表达

目的克隆抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1,HnRNPA2/B1)单克隆抗体的重链可变区(variableregionofheavychain,VH)和轻链可变区(variableregionoflightchain,VL)基因,构建抗HnRNPA2/B1单链抗体(singlechainFv,ScFv)基因,并在大肠杆菌表达。方法采用斑点ELISA、Western印迹和免疫组化检测抗HnRNPA2/B1单克隆抗体3E8的特异性,并通过逆转录-聚合酶链反应、重叠延伸PCR来克隆、串联VH和VL基因,构建抗HnRNPA2/B1ScFv基因pET28(a )表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、竞争抑制ELISA检测表达产物。结果3E8抗体能特异性地与HnRNPA2/B1合成肽以及3株人肺癌细胞内HnRNPA2/B1结合;克隆的VH基因为345bp,VL基因为309bp,符合小鼠抗体可变区特性;抗HnRNPA2/B1ScFv蛋白以包涵体形式表达,分子量约28000,并具有与抗原结合活性。结论成功构建了抗HnRNPA2/B1ScFv基因克隆,并在大肠杆菌中获得了功能性表达,为阐明HnRNPA2/B1与肺癌相关性奠定了实验基础。     

具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因。方法提取杂交瘤细胞的总RNA ,分离mRNA ,反转录合成cDNA。经PCR扩增VH 基因和VL 基因 ,将VH 基因和VL基因与载体 pGEM T连接后 ,进行酶切鉴定和序列分析。结果构建了2个分别含有VH 和VL 基因的重组质粒。序列分析表明 ,VH 和VL 分别属于mouscheavychainsubgroupIII和mouselightchainsubgroupV亚群 ,长度为372和324bp ,编码124和108个氨基酸 ,在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论克隆的VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料。     

杂交瘤细胞在玻璃微载体培养中生物特性观察

本文报道以玻璃微载体小珠(CMB,Class microcarrier beads)作为载体培养杂交瘤细胞方法的建立。结果表明4株杂交瘤细胞在GMB培养显示GNB法上清中特异性单克隆抗体的滴度。OD值较单层培养法为高。比较培养7d后的杂交瘤细胞数,也以GMB法获得细胞数为多。各株细胞都诱生出高滴度腹水。亚类鉴定方面,GMB法培养的4株杂交瘤细胞上清内McAb所属亚类,又都保持了与单层法培养者完全相同的结果。表明杂交瘤细胞在CMB培养中,细胞迅速增殖,且保持各细胞株分泌其特异的McAb的生物特性,细胞活力旺盛,为今后体外培养杂交瘤细胞,制备McAb,提供了新的途径。     

抗BAFF单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定

目的:在本实验室成功制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人BAFF单克隆抗体杂交瘤细胞FMMUB4中提取总RNA,以此为模版反转录成cDNA,用针对小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应,PCR产物连接入载体,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因,测序结果证实序列正确。结论:获得了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因序列,为下一步构建相关基因工程抗体打下良好基础。     

Characterization and gene cloning of monoclonal antibody specific for the hepatitis B virus X protein

The hepatis B virus X protein (HBx) has been thought to be implicated in the development of hepatocellular carcinoma. Although many functions of HBx have been reported, it is not clear which of HBx functions is important in hepatocellular carcinogenesis. To study HBx function, we produced a monoclonal anti-HBx Ab secreted by hybridoma cell clone H7 and mapped its epitope to a region of HBx between amino acids 29 and 48 by Western blot with truncated forms of HBx and by enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) with synthetic HBx peptides. The variable regions of H7 anti-HBx Ab were cloned by polymerase chain reaction using the degenerate-primers and by the 5' rapid amplification-cDNA end method. The sequence analyses revealed that the variable gene segments of the heavy and light chains are the members of mouse heavy chain variable gene 1 family and kappa light chain variable gene 2 family, respectively. In addition, J(H)2 or Jkappa4 gene segment at the end of the heavy-chain or light-chain variable region and DSP2.x gene segment in the CDR 3 of heavy chain were identified.