石杉碱甲联合尼莫地平治疗血管性痴呆的对照观察

目的观察石杉碱甲联合尼莫地平治疗轻、中度血管性痴呆（VD）的临床疗效和安全性。方法 64例轻、中度VD患者随机分为两组。治疗组32例,服用石杉碱甲100ug,2次/日,尼莫地平30mg,3次/日。对照组32例,服用石杉碱甲100ug,2次/日。两组总疗程为12周。采用简易精神状态检查表（MMSE）、日常生活能力量表（ADL）作为评价指标。结果石杉碱甲联合尼莫地平治疗12周后MMSE、ADL分数分别较对照组明显改善（23.25±2.71,25.39±5.37,P〈0.01）。结论石杉碱甲联合尼莫地平治疗血管性痴呆（VD）较单用石杉碱甲可显著改善VD患者的认知功能,且安全性良好。     

石杉碱甲快速检测酶联免疫试剂盒的制备

目的:制备并鉴定石杉碱甲单克隆抗体,研制石杉碱甲间接竞争酶联免疫试剂盒。方法:以石杉碱甲人工抗原免疫BALB/c小鼠获得单克隆抗体,采用酶联免疫吸附法制备石杉碱甲试剂盒,对试剂盒各项指标进行评价。结果:试剂盒工作范围为5~2 500 ng/ml,检测限为6.242 ng/ml,与多种生物碱均无交叉反应,试剂盒可在4℃或-20℃下稳定贮存半年以上,石杉碱甲片回收率在94.2%~108.6%之间,变异系数在2.3%~4.8%之间。结论:石杉碱甲ELISA试剂盒快速、灵敏、稳定,可用于石杉碱甲的含量测定。     

石杉碱甲通过TLR4/NF-KB信号通路抑制Aβ25-35诱导的神经胶质细胞炎症反应的实验研究

目的 研究石杉碱甲对Aβ25-35诱导的神经胶质细胞BV-2细胞的炎症反应抑制作用及机制.方法 将BV-2细胞分为5组:对照组、造模组和不同浓度石杉碱甲(0.1 μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L)干预组.对照组为正常培养,造模组为Aβ25-35作用细胞24 h制造炎症模型,干预组先分别给予不同浓度...     

国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究

 目的 以国产培养基替代昂贵进口培养基发酵培养重组人超氧化物歧化酶（rhSOD）工程菌。 方法 利用国产 LB 培养基对自行构建的含重组质粒 pTK- rhSOD 的基因工程菌 E.coli DH5α 通过摇瓶进行发酵培养，以 SDS-PAGE 分析方法考察不同菌体接种量（1% ~ 5%）、菌体生长密度[波长 600 nm 处吸光度（A600）值]、诱导时间（1 ~ 8 h）、氨苄青霉素（Amp）浓度（终浓度150、200、250 μg/ml）及加入时机（分别于接种前和诱导前加入）、摇瓶装液量（10% ~ 40%）和诱导温度（42、43、44、45 ℃）对 rhSOD 表达的影响，优选最适培养条件，并与进口 LB 培养基进行比较。 结果 对于国产 LB 培养基，采用 3% ~ 5% 接种量，菌体密度生长至 A600 达 0.38 ~ 0.63，诱导前补加Amp由初始的 100 μg/ml 至 200 μg/ml，于 42 ~ 44 ℃ 诱导 3 ~ 5 h，rhSOD 表达量可达 30%；对于进口 LB 培养基，采用 2%接种量，菌体密度生长至 A600 达 0.55 ~ 0.93，诱导前补加Amp 由初始的 100 μg/ml 至 150 μg/ ml，于 42 ~ 43℃ 诱导 2 ~ 4 h，rhSOD 表达量可达 30%。两种培养基摇瓶装液量对 rhSOD 的表达均没有明显影响。 结论 国产 LB 培养基经条件优化后可获得与进口培养基相同的目的蛋白表达量，可以替代昂贵的进口产品，为 rhSOD 进一步规模化生产降低发酵成本提供了实验依据。     

单链抗体与力达霉素融合蛋白在链霉菌中的表达

 目的 构建可表达力达霉素（LDM）辅基蛋白基因与抗 IV型胶原酶单链抗体（scFv）融合蛋白的重组菌株，获得既具有靶向性、又具有抗肿瘤活性的 scFV-LDM。方法 以大肠埃希菌-链霉菌穿梭质粒 pBS03 为基础构建同源双交换质粒 pBS-scFv，利用接合转移将该质粒转入球孢链霉菌（S. globisporus）C-1027，根据抗性差异筛选获得重组菌株。用 PCR、DNA 印迹法对重组菌株进行验证。用 SDS-PAGE 检测重组菌株中目的融合蛋白的表达。用抑菌圈试验检测重组菌株发酵液的抑菌活性。 结果 经同源重组得到重组菌株 S. globisporus C-1027- scFv。PCR 显示重组菌株扩增产物与预期一致，DNA 印迹分析显示重组菌株得到与预期吻合的杂交片段，表明 scFv-LDM 融合蛋白基因已经成功取代 LDM 辅基蛋白基因。SDS-PAGE 结果显示重组菌株不再产生辅基蛋白。抑菌圈试验显示重组菌株发酵液在第 5 天能够检测到抑菌活性。初步结果表明，重组菌株可产生 scFv-LDM 融合蛋白。 结论 成功构建了可产生 scFv-LDM 融合蛋白且具有分泌活性的重组菌株。这对改造和研发新型单抗导向药物有实际意义。     

快速检测游离前列腺特异性抗原 ELISA 方法的建立

 目的 建立快速检测人血清中游离前列腺特异抗原（f-PSA）的 ELISA 方法。 方法 利用抗 f-PSA 的单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株，一株单抗 2D1 用于固相包被，另一株单抗2E4进行辣根过氧化物酶标记，采用二步法，建立定量测定人血清 f-PSA 的双抗体夹心ELISA法。对该法的敏感度、精密度、准确性、特异性进行了分析。应用该法与瑞典 CanAg 公司的f-PSA ELISA 试剂盒同时检测了 18 例前列腺癌和 25 例前列腺增生患者血清标本的 f-PSA 含量，进行了两种方法检测结果的相关性分析。 结果 以双抗体夹心 ELISA 法检测 f-PSA，在 f-PSA 0 ~ 20 μg/L 范围内线性良好；敏感度为 0.025 μg/L；批内变异系数为 4.5% ~ 6.2%，批间变异系数为 3.9% ~ 7.2%；回收率为 94.3% ~ 111.1%；与 α1 抗糜蛋白酶结合的结合型PSA 交叉率为 0.7 %；检测 43 份临床标本 f-PSA 含量的结果与瑞典 CanAg 公司 f-PSA 试剂盒检测结果的相关系数为 0.995。 结论 所建立的双抗体夹心 ELISA 方法是一种特异、敏感、简便实用的 f-PSA 快速检测方法，有助于在 PSA 低水平升高的重叠范围内（4 ~ 10 μg/L）鉴别前列腺增生与前列腺癌。     

重组人 PTP1B 的原核高效表达及TFLC的体外抑制剂实验

 目的 高效诱导表达并纯化具有活性的重组 PTP1B 融合蛋白（rhPTP1B）,进行酶活性及抑制剂的实验。方法 重组体 pGEX-hPTP1B 转化 E.coliDH5α,诱导表达 rhPTP1B 并优化条件后,超声取细胞裂解上清液经 GST 亲和层析柱纯化后,利用 rhPTP1B 水解特异性底物 4-硝基苯基磷酸二钠盐（pNPP-Na2）的磷酸基团而产生颜色反应来测定 rhPTP1B 活性,并分析其与 rhPTP1B 浓度、底物浓度及反应温度的关系,钒酸钠（Na3VO4）抑制类型的研究,老鹰茶总黄酮（TFLC）对 rhPTP1B 的抑制性作用和浓度依赖关系。 结果 rhPTP1B 表达的最适条件是在 34 ℃ 和 2.0 mmol/L IPTG 下诱导表达 10 h,可被 GST 亲和层析法分离纯化;其活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加,35 ℃ 时 rhPTP1B 的活性最大;钒酸钠的作用机制可能为非竞争性抑制作用;TFLC 对 rhPTP1B 有明显的抑制作用。结论 诱导表达纯化的 rhPTP1B 融合蛋白可用于抑制剂的研究,TFLC 对 rhPTP1B 的强抑制作用可能是其降低糖尿病大鼠血糖浓度的机制之一。     

极低密度脂蛋白对HK-2细胞hUAT基因表达的影响

 目的 观察不同浓度极低密度脂蛋白（VLDL）是否调节肾小管上皮细胞（HK-2细胞）人尿酸盐转运子（hUAT）mRNA的表达。方法 根据培养液中所含VLDL浓度的不同，将HK-2细胞分为：①仅使用DMEM/F-12组（对照组）；②DMEM/F-12+ 50 μg/ml VLDL组（V1组）；③DMEM/F-12+100 μg/ml VLDL组（V2组）；④DMEM/F-12+200 μg/ml VLDL组（V3组）；⑤DMEM/F-12+400 μg/ml VLDL组（V4组）。每组均培养 6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48 h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量（2^ΔΔCt法）。结果 所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达，但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组，其中，VLDL最低浓度（50 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%，VLDL最高浓度（400 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论 VLDL下调hUAT mRNA表达，VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。     

极低密度脂蛋白对HK-2细胞hUAT基因表达的影响

 目的 观察不同浓度极低密度脂蛋白（VLDL）是否调节肾小管上皮细胞（HK-2细胞）人尿酸盐转运子（hUAT）mRNA的表达。方法 根据培养液中所含VLDL浓度的不同，将HK-2细胞分为：①仅使用DMEM/F-12组（对照组）；②DMEM/F-12+ 50 μg/ml VLDL组（V1组）；③DMEM/F-12+100 μg/ml VLDL组（V2组）；④DMEM/F-12+200 μg/ml VLDL组（V3组）；⑤DMEM/F-12+400 μg/ml VLDL组（V4组）。每组均培养 6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48 h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量（2^ΔΔCt法）。结果 所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达，但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组，其中，VLDL最低浓度（50 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%，VLDL最高浓度（400 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论 VLDL下调hUAT mRNA表达，VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。     

再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞转化生长因子β1及Smad3表达下调的发病学意义

 目的 研究骨髓间充质干细胞（MSC）中转化生长因子 β1（TGF-β1）与 Smad3 的表达下调与再生障碍性贫血（再障）发生的可能关系。 方法 取 20 例重型再障患者骨髓 MSC，分离制备出 Flk1+CD34–MSC 后进行以下试验：①体外定向诱导 MSC向脂肪细胞分化，倒置显微镜观察成脂分化情况，油红 O染色法鉴定脂肪细胞，用实时荧光定量 PCR 检测分化过程中脂蛋白酯酶（LPL）基因的表达；②用蛋白质印迹法检测MSC 中 TGF-β1 及 Smad3 的表达，用 ELISA 检测 MSC分泌 TGF-β1 的能力；③观察不同剂量（0、5、10、15、20 ng/ml）TGF-β1 对再障患者骨髓 MSC 成脂分化和增殖的影响。以 7 名健康成人的骨髓 MSC 相应检测为对照。 结果 再障患者骨髓 MSC 经 4 d 培养后即分化为脂肪细胞，而健康成人骨髓 MSC 中仅见少量细胞出现脂肪滴。再障患者 MSC 培养 4 和 8 d 时 LPL 基因表达水平分别为 0.091 ± 0.028、0.142 ± 0.033，均高于健康成人骨髓 MSC（分别为 0.021 ± 0.011 及 0.049 ± 0.010，均 P < 0.01）；而 TGF-β1 及 Smad3 表达水平明显低于健康成人骨髓 MSC，TGF-β1 分泌水平（3.4 μg/L ± 0.9 μg/L）也明显低于健康成人骨髓 MSC（11.6 μg/L ± 1.2 μg/L，P < 0.01）。在向脂肪细胞分化过程中，仅加入 5 ng/ml 的 TGF-β1 即可明显抑制再障患者骨髓 MSC 向脂肪细胞定向诱导分化，同时促进其增殖。 结论 再障患者骨髓 MSC 中 TGF-β1 及 Smad3 表达水平的显著下调可能参与了再障的部分发病环节。     

Optimization of trehalose production by a novel strain Brevibacterium sp. SY361

Trehalose production by a novel strain of Brevibacterium sp. SY361 was optimized in submerged fermentation. Different chemical and physical parameters such as carbon and nitrogen sources, inoculum level, initial pH, incubation temperature, aeration and time-course of fermentation, were studied in order to increase trehalose productivity. An optimal production medium containing 3% (w/v) glucose, 0.9% (v/v) corn steep liquor, 0.5% (w/v) KH(2)PO(4) and 0.4% (w/v) MgSO(4).7 H(2)O was found suitable for trehalose production. An optimal volume of medium in a 500 ml flask was 80 ml. The optimal levels of other parameters were 4.0% (v/v) of inoculum, initial pH of 6.0, incubation temperature of 28-32 degrees C and time-course of 60 h. Optimized parameters gave a maximum trehalose of 12.2 mg/ml with a conversion rate of 58.4%.     

体外研究人细胞色素P450 3A4等位基因多态性对药物代谢和药物相互作用的影响

 目的 体外研究药物对人细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）（野生型，WT）及其 4 个突变等位基因重组酶 CYP3A4*3（M445T）、CYP3A4*4（I118V）、CYP3A4*17（F189S）和CYP3A4*18（L293P）的抑制程度。 方法 采用荧光高通量法和 HPLC 法分别测定 WT 及其 4 个突变等位基因重组酶催化荧光底物——二甲基荧光素（DBF）脱烷基化和探针底物——硝苯地平氧化反应时的酶动力学参数；且通过测定大扶康、万络、西乐葆、酮康唑、地尔硫卓和维拉帕米的半数抑制浓度（IC50）值，确定6 种药物对酶的抑制程度。 结果 除 F189S 外，其余 4 种重组酶均能催化DBF 和硝苯地平反应生成相应的产物。各突变等位基因重组酶催化 DBF 反应的 Km 值（亲和力）与 WT 相当，M445T 和 L293P 的内在清除率分别是 WT 的 3.1 和 3.8 倍（P < 0.05），I118V 是 WT 的 1.3 倍（P = 0.1010）。各重组酶催化硝苯地平氧化反应的 Km 值均比 WT 小，I118V 和 L293P 的内在清除率分别是 WT 的 0.7 和 2.6 倍（P < 0.05），M445T 与 WT 相当（P = 0.7676）。6 种药物对各重组酶的抑制程度强弱均为：酮康唑 > 地尔硫卓 > 维拉帕米 > 大扶康 > 西乐葆 > 万络；药物对各重组酶的 IC50 值大小为：WT < L293P < M445T < I118V。 结论 等位基因突变导致了酶动力学特征的改变和药物对酶抑制程度的不同，为进一步研究临床联合用药安全性奠定基础。     

甘氨酸和 Triton X-100 对 ZZ-EGFP 融合蛋白分泌表达影响的初步研究

 目的 考察不同浓度的甘氨酸和 Triton X-100 对葡萄球菌蛋白质 A ZZ 亲和肽-增强型绿色荧光蛋白（ZZ-EGFP）融合蛋白在大肠杆菌分泌表达的影响。 方法 研究设计为两因素三水平析因设计。向液体培养基中分别加入终浓度 0、1%、2% 的甘氨酸和 0、1%、2% 的 Triton X-100（共 9 种组合方式，终浓度均为 0 者为对照组），诱导大肠杆菌周质腔内 ZZ-EGFP 融合蛋白泄漏到液体培养基中，以培养上清液荧光强度为观察指标，通过 ZZ- EGFP 融合蛋白浓度-荧光强度标准曲线快速检测培养基中 ZZ-EGFP 融合蛋白表达量。 结果 培养基中分别加入 1%、2% 甘氨酸或 1%、2% Triton X-100 培养后，培养上清液荧光强度分别为 283 ± 11、711 ± 19 和 622 ± 25、733 ± 25，与对照组（74 ± 5）比较，组间差异均有统计学意义（甘氨酸：F = 10.881，P = 0.024；Triton X-10：F = 12.848，P = 0.018）；而且甘氨酸与 Triton X-100两者之间有交互效应（F = 5.441，P = 0.005），其中培养基中同时含有终浓度 2% 甘氨酸及 1% Triton X-100 时培养上清液荧光强度最高（1854 ± 45），ZZ-EGFP 融合蛋白分泌表达量达到 10.4 mg/L，与对照组（0.94 mg/L）相比提高了 11 倍。 结论 甘氨酸和 Triton X-100 能提高 ZZ-EGFP 融合蛋白在液体培养基中的分泌表达量。     

Effects of culturing conditions on production of D-hydantoinase from recombinant Escherichia coli.

The effects of culturing conditions on D-hydantoinase production by a recombinant Escherichia coli strain were investigated using a controlled fed-batch fermentation system. Glucose concentration and pH of the culture broth were maintained at less than 3.3 g/L and at 7.0, respectively, in a 5 L jar fermentor. The optimal composition of the batch medium was glucose, 0.25%; yeast extract, 0.75%; (NH4)2SO4, 0.25%; KH2PO4, 0.2%. The optimal feeding solution was glucose, 60%; yeast extract, 30%; ammonia water, 9%. Following 25-h cultivation, 0.02 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside was added to induce dht gene expression and the temperature was shifted from 32 to 27 degrees C to avoid inclusion body formation. The plasmid-harboring dht gene was found to be stably maintained in the E. coli. Under optimal conditions, a cell density of about 25 g dry cell weight/L and a high volumetric productivity of 8300 U/L/h could be achieved after 48 h culture at agitation and aeration rates of 1000 revolutions per minute and 1 vvm, respectively.     

液体菌种培养时间对灵芝液体发酵的影响

目的 探讨灵芝液体菌种培养时间对灵芝液体发酵的影响。 方法 将灵芝菌块接种于液体摇瓶菌种培养基中，置于25℃恒温培养箱内静置培养24h，然后分别恒温振荡培养4、5、6d，分别命名为4号、5号、6号液体菌种，把各号液体菌种转接于液体培养基中继续培养，观察不同液体菌种发酵过程中发酵液pH值、菌丝量和胞外粗多糖含量的变化。 结果 在发酵过程中4号菌种的发酵液pH值先下降后上升，其他2个菌种变化不明显。在液体发酵第7天时，5号菌种发酵液中的菌丝量明显高于4号、6号，达到10．2mg／ml。在液体发酵第4天时，4号与5号液体菌种发酵液中胞外多糖的含量最多，6号液体菌种则推迟2d。发酵液中胞外多糖含量以5号最高，4号次之，6号最低。 结论 液体菌种培养时间对于灵芝发酵液中菌丝量有明显影响，而对胞外粗多糖含量无明显影响；6d是灵芝液体菌种最佳培养时间长度。     

Evaluation of laccase production by Ganoderma lucidum in submerged and solid‐state fermentation using different inducers

Laccases are multicopper oxidases with high potential for industrial applications. Several basidiomycete fungi are natural producers of this enzyme; however, the optimization of production and selection of inducers for increased productivity coupled with low costs is necessary. Lignocellulosic residues are important lignin sources and potential inducers for laccase production. Pinus taeda, a dominant source of wood‐based products, has not been investigated for this purpose yet. The aim of this study was to evaluate the production of laccase by the basidiomycete fungus Ganoderma lucidum in the presence of different inducers in submerged and solid‐state fermentation. The results of submerged fermentation in presence of 5 μM CuSO ₄, 2 mM ferulic acid, 0.1 g/L P. taeda sawdust, or 0.05 g/L Kraft lignin indicated that although all the tested inducers promoted increase in laccase activity in specific periods of time, the presence of 2 mM ferulic acid resulted in the highest value of laccase activity (49 U/L). Considering the submerged fermentation, experimental design following the Plackett–Burman method showed that the concentrations of ferulic acid and P. taeda sawdust had a significant influence on the laccase activity. The highest value of 785 U/L of laccase activity on submerged fermentation was obtained on the seventh day of cultivation. Finally, solid‐state fermentation cultures in P. taeda using ferulic acid or CuSO ₄ as inducers resulted in enzymatic activities of 144.62 and 149.89 U/g, respectively, confirming the potential of this approach for laccase production by G. lucidum.     

Effect of pH, ions, bovine serum albumin and heterologous antisera on the stability of immunosorbed flexuous potato viruses

Electron microscopic studies on the stability of immunosorbed (trapped) virions of potato viruses X, S and Y0 (PVX, PVS and PVY0) revealed disintegration and dislodging of PVY0 virions upon incubation with (1) antisera to PVX, PVS, or both diluted in saline, (2) 0.86% NaCl (saline) or 0.1 mol/l CaCl2 but not with 0.1 mol/l CaSO4 or 0.1 mol/l MgSO4. PVX virions, on the other hand, showed partial dislodging upon incubation with an antiserum to PVS diluted in saline, but complete disintegration and dislodging with saline. 0.1 mol/l CaCl2 caused partial dislodging while MgCl2, CaSO4 or MgSO4 (all 0.1 mol/l) had no apparent adverse effect. PVS virions were not affected by saline, CaCl2, MgCl2, CaSO4 or MgSO4 (all 0.1 mol/l) and were only partially dislodged by antisera to PVX or PVY0. Disintegration and/or dislodging of the PVX and PVY0 virions was prevented when (1) they were fixed with glutaraldehyde prior to incubation or (2) the virus extract contained bovine serum albumin (BSA) or (3) heterologous antisera were diluted in 0.1 mol/l phosphate buffer (PB) before use except the PVS antiserum which still caused disintegration and dislodging of PVY0 virions. Prior fixation of virions prevented their disruption and dislodging by saline only in the case of PVY0 but not PVX. On the other hand, BSA reverted the adverse effect of saline but not that of the PVS antiserum on PVY0 virions. The results presented here suggest (1) a disruptive effect of Cl' on PVX and PVY0 virions particularly when it was associated with Na+ and (2) an interaction between the immunosorbed virions of PVX or PVY0 and the antiserum to PVS.     

Self-setting properties and in vitro bioactivity of Ca3SiO5/CaSO4.1/2H2O composite cement

In this study, a biphasic injectable bone substitute, based on tricalcium silicate (Ca(3)SiO(5)) and plaster (CaSO(4).1/2H(2)O), is presented. The addition of CaSO(4).1/2H(2)O could accelerate the hydration of Ca(3)SiO(5), decrease the setting time, and improve the strength of the cement. The workable Ca(3)SiO(5)/CaSO(4).1/2H(2)O pastes with a liquid to powder (L/P) ratio of 0.8-1.0 mL g(-1) could be injected for 2-20 min (nozzle diameter 2.0 mm) and enabled initial setting times of 9-60 min. The setting process yielded cellular structures with compressive strength of 12.4-31.5 MPa after 2-28 days. The in vitro bioactivity of the paste was investigated by soaking in simulated body fluid (SBF) for 7 days. The result showed that although large amount of CaSO(4).1/2H(2)O (30%) was added, the paste showed good ability to induce the formation of hydroxyapatite (HA). Furthermore, the Ca(3)SiO(5)/CaSO(4).1/2H(2)O paste could degrade in Ringer's solution, and the dissolution extracts of the paste also had a stimulatory effect on L929 cell growth in certain concentration range. Our results indicated that Ca(3)SiO(5)/CaSO(4).1/2H(2)O paste was bioactive and degradable, and showed excellent mechanical properties after self-setting. Therefore, it may be a potential candidate for further investigation as injectable tissue repairing substitute.