双靶点沉默hTERT和Bi-1基因诱导人鼻咽癌细胞凋亡的初步研究

目的利用RNA干扰阻抑hTERT和Bi-1基因的表达并诱导人鼻咽癌细胞的凋亡。方法收集CNE-2Z细胞,设未处理组、Lip组、pcDNA3.1(+)/Lip对照组、TR/Lip组、TRs/Lip组、Bi-1/Lip组、Bi-1s/Lip组、TR-Bi-1/Lip组和TRsBi-1s/Lip组,采用MTT法观察质粒载体及转染试剂对CNE-2Z细胞生长增殖的影响;采用流式细胞术检测CNE-2Z细胞凋亡,Hoechst 33258染色,采用荧光显微镜观察鼻咽癌细胞形态学的变化。结果 TR、Bi-1和TR-Bi-1组的CNE-2Z细胞增殖能力显著降低,且TR-Bi-1组的生长增殖能力最低(P<0.05);凋亡细胞有所增加。转染TR、Bi-1和TR-Bi-1重组质粒48 h后,荧光显微镜下可见部分鼻咽癌细胞出现典型的凋亡形态学变化;而pcDNA3.1(+)、TRs、TRs-Bi-1s、Lip和未处理组则无明显变化。结论双基因表达载体可以同时特异、有效地沉默hTERT和Bi-1两种基因,与沉默单基因的效果相比较,双基因沉默组鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖率受到明显抑制。     

IL-15cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的建立转人白细胞介素-15(hIL-15)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-15的表达情况。方法将携带人白细胞介素-15的质粒pcDNA3.1( )-hIL-15转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Westernblot和ELISA法对hIL-15的表达进行检测。结果IL-15基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达。RT-PCR电泳结果显示hIL-15基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-15的含量为(185.0±12.2)pg/ml,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-15。结论hIL-15基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达。     

人白细胞介素10基因克隆及真核表达

目的建立人白细胞介素-10(hIL-10)真核表达系统并观察其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达。方法用RT—PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10cDNA，将其克隆至pMD18-T中，测序正确后，再定向插入至真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染CHO细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌并进行活性检测。结果RT—PCR扩增的hIL-10cDNA序列与GenBank中hIL-10cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneO—hIL-10；转染CHO细胞后可检测到具生物活性的hIL-10的转录和表达。结论成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物生产打下基础。     

RNA干扰硒蛋白V基因对人恶性黑色素瘤细胞A375生物学行为的影响（英文）

目的体外观察sh RNA靶向干扰硒蛋白V(SELV)基因对人恶性黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法构建以SELV为靶基因的sh RNA表达载体,将其转染至体外培养的A375细胞中,并利用嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。采用实时荧光定量反转录PCR(q RT-PCR)和Western blotting法分别检测转染细胞SELV的m RNA和蛋白表达水平;采用MTT法检测转染后细胞的增殖能力,并利用流式细胞术检测转染细胞的细胞周期和早期凋亡率。采用q RT-PCR和ELISA法对转染细胞的SELV功能相关因子含锚蛋白重复序列-细胞因子信号抑制物盒蛋白家族9(ASB9)和O-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)的表达情况进行检测。结果成功构建靶向SELV的sh RNA重组质粒,并获得稳定转染的A375细胞。转染后SELV的表达显著降低(P<0.05),细胞增殖和细胞周期未发生明显变化,但细胞早期凋亡率显著增加(P<0.05)。而转染细胞的ASB9和OGT表达量也明显增加(P<0.05)。结论靶向SELV的sh RNA重组质粒能够下调SELV在A375细胞中的表达,提高细胞早期凋亡率,并导致ASB9和OGT的表达升高。     

RNA干扰沉默EZH2基因对人卵巢癌细胞增殖迁移的抑制作用

目的:探讨RNA干扰沉默EZH2基因对人卵巢癌细胞系A2780增殖和迁移的影响。方法:真核表达载体介导靶向沉默EZH2 shRNA的重组质粒转染A2780细胞,Real-time RT-PCR检测EZH2基因的沉默效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell小室检测细胞迁移。结果:EZH2shRNA转染明显下调EZH2的表达(P0.001)。重组质粒稳定转染至A2780细胞后,细胞增殖速度明显下降(P0.05),G0/G1期细胞增加(P0.01),体外迁移能力下降(P0.01),差异均有统计学意义。结论:EZH2基因沉默能有效抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力,为卵巢癌的表观遗传学治疗提供新靶点。     

白细胞介素10基因克隆及其真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人白细胞介素10(hIL-10)基因,以构建真核表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达情况。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增hIL-10基因,分别构建含hIL-10目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,经酶切、PCR和DNA测序鉴定;重组表达载体pVAX1-hIL10转染COS-7细胞,观测hIL-10的瞬时表达情况。结果构建了重组克隆载体pMD18T-hIL10和真核表达载体pVAX1-hIL10,经酶切、PCR及测序鉴定正确,插入片段序列与GenBank已公布的hIL-10基因序列一致;pVAX1-hIL10可以有效地转染COS-7细胞,Western blot结果表明hIL-10在COS-7细胞中瞬时表达。结论成功克隆了hIL-10基因,构建的表达载体pVAX1-hIL10在COS-7细胞中瞬时表达hIL-10蛋白,为进一步研究其生物学功能和临床应用奠定了基础。     

H_2O_2对人鼻咽癌细胞系CNE-2Z生长和增殖的影响

目的观察H2O2对人鼻咽低分化鳞癌细胞系CNE-2Z细胞生长、增殖的影响,并探讨其可能机制。方法应用H2O2体外诱导培养CNE-2Z细胞,用生长曲线、MTT及平板克隆形成观察H2O2对肿瘤细胞生长、增殖的影响,以流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡,以W estern B lot分析诱导培养后细胞中EGR-1、P53、P16、Cyc lin D1的表达。结果生长曲线、MTT及平板克隆形成实验表明不同浓度H2O2对CNE-2Z细胞生长、增殖具有明显抑制作用;流式细胞仪检测发现H2O2诱导培养后细胞周期进程减慢(G1期阻滞)、凋亡增加;W estern B lot检测发现CNE-2Z细胞缺失EGR-1、P16表达,H2O2诱导培养后可见EGR-1短暂高表达,但无P16表达,且EGR-1表达与P53表达水平呈正相关(P<0.05);Cyc lin D1表达与EGR-1表达无明显相关性(P>0.05)。结论人鼻咽低分化鳞癌细胞系CNE-2Z中EGR-1表达缺失,H2O2体外诱导培养后可见其一过性高表达,且其表达水平与P53表达相一致,两者可能在H2O2所致的细胞生长抑制及凋亡中起作用。一定浓度的H2O2在体外实验中显示出对CNE-2Z细胞具有生长抑制作用,并能诱导细胞凋亡。     

改变鼻咽癌细胞免疫原性对其迁移能力的影响

目的探讨改变鼻咽癌细胞的免疫原性对鼻咽癌迁移能力的影响。方法运用激光扫描共聚焦显微镜观察鼻咽癌细胞MHC-I、MHC-II分子的表达,划痕迁移实验检测鼻咽癌细胞的迁移能力。细胞分为四组:A组:鼻咽癌CNE-2Z细胞;B组:鼻咽癌CNE-2Z细胞+IL-2;C组:鼻咽癌CNE-2Z细胞+IFN-γ;D组:鼻咽癌CNE-2Z细胞+IL-2+IFN-γ。对各组结果进行比较分析。结果 A组鼻咽癌细胞的MHC-I、MHC-II分子几乎不表达,B组、C组和D组鼻咽癌细胞的MHC-I分子增强,MHC-II分子没有明显变化,其免疫原性增强。细胞划痕迁移实验表明,与A组比较,B组、C组和D组鼻咽癌细胞的迁移能力减弱,有统计学意义(P<0.05)。结论改变鼻咽癌细胞的免疫原性对其迁移能力有影响,使鼻咽癌细胞的免疫原性增强,其迁移的能力减弱。     

IL-24在母胎界面的表达及其对TEV-1细胞侵袭能力的影响

目的:研究IL-24在早孕期母胎界面的表达及其对绒毛外滋养细胞系TEV-1体外侵袭能力的影响。方法:免疫组化法检测早孕期绒毛及蜕膜组织中IL-24的表达情况;MTT法检测人重组IL-24蛋白对TEV-1细胞增殖的影响;用Transwell小室体外侵袭实验,分析绒毛外滋养细胞在IL-24作用下的侵袭能力。结果:早孕期绒毛及蜕膜组织均有IL-24的表达,分布于绒毛柱、滋养细胞、间质及血管内;不同浓度的人重组IL-24蛋白对TEV-1细胞增殖无影响;人重组IL-24对TEV-1细胞的侵袭能力有抑制作用,并呈一定的浓度依赖性。结论:IL-24可抑制TEV-1细胞的侵袭能力,因此早孕期母胎界面产生的IL-24可能影响滋养细胞的侵袭过程,在妊娠过程中有重要意义。     

siRNA抑制IKCa1基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:研究siRNA(small interfering RNA)抑制钙激活性中电导钾离子通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IKCa1)表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法:构建含有IKCa1基因的siRNA表达载体,脂质体法转染HeLa细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测HeLa细胞IKCa1 mRNA和蛋白表达变化;WST-1检测细胞增殖能力;流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化。结果:成功构建针对IKCa1基因的真核表达载体,所获表达载体转染HeLa细胞可使IKCa1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),并能有效抑制HeLa细胞增殖(P<0.05),使细胞周期停留在G0～G1期,S期细胞明显减少。结论:应用siRNA干扰技术能有效抑制IKCa1基因的表达,同时也可有效抑制宫颈癌HeLa细胞体外增殖活性。     

BRL-CM小鼠胚胎干细胞及体外诱导的研究

目的 探讨以Buffalo大鼠肝细胞培养上清(BRL-CM)替代含LIF培养液体外培养小鼠胚胎干细胞(ESC)的可行性；无血清体外诱导ESC为神经前体细胞(NPC)。方法 以BRL-CM维持ESC生长并抑制其分化，用含LIF的培养液作为对照，硝基四氮唑蓝／5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸(NBT／BCIP)显色检测碱性磷酸酶。采用N2选择性无血清培养法获取NPC，免疫组化法检测巢蛋白(Nestin)鉴定。结果 BRL-CM与含LIP的培养液一样能维持ESC未分化状态，无血清培养基诱导。ESC后获得细胞的86％为NPC。结论 BRL-CM可替代LIF用于ESC培养，且经济、简便。采用N2选择性培养基可获得较高纯度的NPC。     

皮脂腺细胞体外培养及生长调节的研究进展

皮脂腺是皮肤重要的附属器。皮脂腺体外培养模型的建立为研究相关因子如细胞因子、生长激素及药物等对皮脂腺形态功能、生长发育及病理改变的作用提供了良好的平台。本文对皮脂腺细胞体外培养的实验方法、体外生长特性及影响皮脂腺细胞增殖分化的相关因素作简要综述。     

米非司酮对早孕小鼠促性腺激素细胞的形态学影响

研究米非司酮终止早孕时小鼠垂体促性腺激素细胞——FSH细胞、LH细胞的形态学变化。方法:应用免疫组织化学PAP方法,对FSH细胞与LH细胞的阳性细胞密度,细胞质内激素颗粒进行观察。结果:实验组与对照组比较,FSH细胞的阳性细胞密度,细胞质内FSH颗粒无显著性差异;LH细胞的阳性细胞密度,细胞质内LH颗粒均明显减少,有显著性差异(P<0.05)。结论:米非司酮对早孕小鼠的FSH细胞的功能无明显影响;对LH细胞的功能有显著的抑制作用。     

孕期母胎界面及母血中T、NK细胞研究进展

胚胎对于母体来说是半异己的同种移植物,母体免疫系统中的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原,直接影响妊娠的建立与维持.所以研究孕期母胎界面及母血系统免疫中T细胞和NK细胞免疫状态可以帮助了解妊娠免疫耐受的机制,也可以认识一些严重影响妊娠结局的病理妊娠的发病机制.该文主要对孕期母胎界面及母血系统免疫中T细胞表面标记、辅助细胞1/辅助细胞2模式、自然杀伤细胞分泌细胞因子及自然杀伤细胞表面标记与杀伤活性的变化的研究进展作以综述.     

微小RNA在生殖发育领域中的研究进展

微小RNA（micro RNA, miRNA）是一类新发现的非编码的调控RNA,其主要在转录水平或转录后水平上发挥调控效应,控制着生长发育、分化、代谢和疾病等许多生物过程。miRNA调控精子与卵子的减数分裂,影响配子的生长发育。参与植入前小鼠胚胎早期发育时序的调节,干预植入过程中相关基因的表达。而且涉及到干细胞的自我更新与多潜能性的维持,控制多能胚胎干细胞谱系的决定。生殖细胞miRNA的异常表达与生育能力障碍存在一定相关性。就miRNA相关机制和功能,主要检测方法及其在生殖发育领域中研究进展综述。     

哺乳动物细胞在生物技术药物研究与开发中的应用

分析了20多年来欧美已上市的生物技术药物,指出哺乳动物细胞已成为生物技术药物研发主要采用的基因表达系统。对外源基因高表达工程细胞株、高效工程细胞培养工艺、工程细胞产物分离纯化技术及工程细胞制品的安全性评价等进行了综述分析,并论述了中国哺乳动物细胞工程化技术现状和在药物研发中的作用。     

芹菜素对雌性大鼠卵巢颗粒细胞凋亡影响

目的 探讨芹菜素(apigenin,Api)对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响.方法 选情前期成年雌性SD大鼠20只,取卵巢颗粒细胞进行原代细菌培养,贴壁后随机分为4组(对照组、Api 10-4M组、Api 10-5M组、Api 10-6M组),加入处理因素.培养结束后,收集各组培养卵巢颗粒细胞,经苏木精-伊红染色和吖啶橙染色观察颗粒细胞形态,经MTT法及流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡率,观察Api对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响.结果 MTT法检测对照组,Api 10-4M组、Api 10-5M组、Api 10-6M组A值分别为(0.87±0.059)、(0.29±0.057)(0.49±0.03)、(0.63±0.035);实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),提示实验组颗粒细胞数量减少,出现凋亡细胞;流式细胞仪检测对月强组、Api 10-4M组、Api 10-5M组、Api 10-6M组的颗粒细胞凋亡率分别为(3.63±0.37)%、(36.37±2.28)%、(34.67±1.96)%、(30.92±1.65)%,实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),提示实验组颗粒细胞凋亡率明显增高.结论 Api能抑制卵巢颗粒细胞的增殖,并促进其凋亡.     

壬基酚对体外培养大鼠睾丸支持细胞凋亡影响的研究

目的探讨壬基酚对大鼠睾丸支持细胞的影响及其作用机制.方法建立体外培养大鼠睾丸支持细胞以及混合培养支持细胞和生精细胞体系,以不同浓度的壬基酚(分别为0.2μg/L、1.0 μg/L、3.0 μg/L、5.0 μg/L)作用于支持细胞和混合培养的支持细胞和生精细胞,采用MTT法测定支持细胞的活性,流式细胞仪测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法测定混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量的变化.结果随着壬基酚作用剂量的增大和作用时间的延长支持细胞的活性下降,且支持细胞的凋亡率随着壬基酚浓度的增大而提高;混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量均明显提高.结论壬基酚可引起支持细胞凋亡,进而通过Fas/FasL系统启动生精细胞凋亡.     

丙烯酰胺对胚胎脊髓神经细胞增殖分化影响

目的 研究丙烯酰胺(ACR)对胚胎脊髓神经细胞增殖分化的影响.方法 利用大鼠胚胎脊髓神经细胞进行原代培养,从细胞形态学及细胞计数学角度观察不同浓度ACR对细胞生长与分化的影响;同时测定蛋白质含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,并与对照组进行比较.结果 150,300 μg/ml的ACR对大鼠胚胎脊髓神经细胞无抑制增殖和分化作用,当ACR浓度达到450,600,750 μg/ml时作用才显现,并随着浓度的加大,其抑制作用增强.结论 ACR能抑制胚胎脊髓神经细胞增殖和分化,可能与其能抑制蛋白质合成、DNA有关.