不同移植手术治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究

目的探讨以人羊膜为载体培养的角膜缘干细胞，自体及异体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法制作兔眼角膜缘干细胞完全缺损3个月的模型。实验动物随机分为自体移植组和异体移植组，前者取对侧眼角膜缘组织，后者取异体兔眼角膜缘组织，均以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，培养12d后行角膜缘干细胞羊膜移植术。术后观察3个月，以角膜上皮染色、角膜浑浊和新生血管3项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增生，体外培养12d可形成复层。自体移植组和部分异体移植组术后角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS阳性，而移植后转为阴性；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后呈现角膜上皮结构。部分异体移植组术后出现了免疫排斥反应。结论兔自体角膜缘干细胞羊膜移植术可重建眼表；免疫排斥反应仍是异体角膜缘干细胞羊膜移植术失败的主要原因。     

兔角膜缘上皮细胞培养后自体移植修复

目的：运用培养角膜缘上皮细胞联合人羊膜行自体移植的方法，观察植片修复兔眼角膜上皮的疗效。方法：选用健康新西兰白兔20只，制成右眼角膜缘干细胞缺乏的兔眼模型，其中12只兔行角膜缘上皮细胞培养联合羊膜自体移植，另外8只兔只进行单纯羊膜移植。术后每周对眼表情况进行评分，术后1mo眼角膜进行苏木素-伊红(HE)染色和透射电镜观察。结果：移植了含有自体角膜上皮细胞的兔眼，术后早期都形成了角膜上皮化并明显抑制了新生血管的再生，HE染色和电镜观察表明培养并移植的角膜上皮与正常的角膜上皮无明显差异；而只接受羊膜移植的兔眼，术后又出现角膜混浊和明显的新生血管，表明角膜表面被结膜上皮覆盖。结论：该方法术后早期可以恢复角膜上皮化，重建正常眼表，疗效明显优于单纯羊膜移植。     

异体角膜缘上皮细胞培养后移植的实验研究

目的观察含培养的角膜缘上皮细胞的羊膜片移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上的效果。方法把羊膜为载体组织块培养的角膜缘上皮细胞移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上,术后观察角膜混浊度、角膜新生血管、角膜上皮等情况,定期兔进行病理组织学检查。结果角膜缘上皮细胞在羊膜上培养16d形成3～4层,用含有培养的异体角膜上皮细胞的羊膜片移植的12只兔眼,术后第5天,损伤的角膜表面全部上皮化,第16天开始,12只兔眼逐渐出现排斥反应。结论含培养的角膜缘上皮细胞羊膜片异体移植术后早期角膜全部上皮化,晚期则出现排斥反应。     

兔角膜碱烧伤新鲜羊膜移植后的角膜病理学及超微结构观察

目的观察兔角膜碱烧伤立即行新鲜羊膜移植后的角膜病理学和超微结构变化。方法40只新西兰白兔中随机取4只作为正常对照组,剩余36只制作双眼碱烧伤模型,右眼立即行新鲜羊膜移植术,左眼不做羊膜移植。分别在术后7、14、28d取材分别行HE染色和透射电镜观察。结果光镜、电镜结果显示:羊膜移植组与未移植组相比,上皮愈合好,基质纤维排列整齐,炎细胞浸润轻,新生血管少。结论兔角膜碱烧伤急性期行新鲜羊膜移植可以减少炎症反应、促进角膜上皮愈合、减轻角膜瘢痕形成、减少角膜新生血管形成。     

培养兔自体角膜缘干细胞移植的实验研究

目的 观察以羊膜为载体的兔角膜缘于细胞膜片移植治疗兔角膜缘于细胞缺损的效果。方法 制造兔角膜缘干细胞缺损的动物模型,以右眼为实验眼,从兔左眼取角膜缘组织,将兔角膜缘干细胞消化下来,接种于铺有羊膜的无菌六孔培养板中,待细胞形成多层角膜上皮细胞后,对兔角膜缘干细胞缺损动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行裂隙灯及病理学检查。结果 临床和组织病理学染色证实：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增生、分化为多层角膜上皮细胞;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少或消失。结论 应用角膜缘干细胞羊膜移植术可恢复其角膜上皮结构的完整性,减少角膜新生血管的形成,维持角膜缘的细胞屏障功能。     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

角膜缘移植联合羊膜移植治疗角膜缘缺陷症

目的 探讨角膜缘移植联合羊膜移植术在治疗角膜缘缺陷症中的作用。方法 以自体或异体角膜缘移植手术治疗复发性翼状胬肉、眼化学烧伤、热烧伤等角膜缘缺陷症患者52例59眼，术中随访5－24月。结果 随访期内植片存活，角膜上皮重建，角膜透明性增另，新生血管减退。仅2眼翼状胬肉复发。结论 角膜缘移植联合羊膜移植是一种较好的治疗角膜缘缺陷症的手术方法。     

兔同种异体角膜缘移植角膜印迹细胞学检测

目的 研究兔角膜缘干细胞缺乏和同种异体角膜缘移植后临床和角膜上皮表型的改变。方法 建立兔角膜缘干细胞缺乏模型,1个月后对治疗组进行同种异体角膜缘移植,术后联合使用免疫抑制剂。比较治疗组与非治疗组的临床表现和角膜表型的改变。结果 兔角膜缘干细胞缺乏后,角膜混浊,新生血管化,持续性上皮缺损;角膜上皮为结膜细胞表型。移植术后角膜上皮完整,新生血管减少,角膜透明度增加;上皮恢复角膜表型。结论 兔同种异体角膜缘移植联合术后使用免疫抑制剂是治疗角膜缘干细胞缺乏症的有效方法。印迹细胞学检查是角膜缘干细胞缺乏症诊断和角膜缘移植术后的评价手段。     

羊膜移植联合自体角膜缘移植术治疗陈旧性眼表烧伤

目的 :探讨羊膜移植术联合自体角膜缘移植术对眼表烧伤的治疗效果。方法 :对 11例 11只眼陈旧性眼表烧伤 ,先将增生的薄层纤维血管组织清除干净 ;暴露出透明的角膜及光滑的巩膜面。用保存羊膜 ,及从健眼取得的自体角膜缘进行联合移植。结果 :平均随访 9 0± 2 2个月。术后角膜表面重度血管化的患眼数所占的比率 ( 3 / 11)明显小于术前 ( 9/ 11) (P <0 0 5 )。 3例( 3只眼 )手术失败 ,角膜表面重新血管化。广泛睑球粘连的 2例术后随访期 ,眼球运动障碍解除 ,形成较深的下穹隆部 ,未见重新睑球粘连。术后 0 -Ⅰ级角膜透明度的患眼数所占的比率 ( 7/ 11)明显大于术前 ( 1/ 11) (P <0 0 5 )。手术前 ( 9/ 11)、及手术后单眼盲目率 ( 4 / 11)相比较有显著性差异 (P <0 0 5 )。结论 :①单眼陈旧性眼表烧伤累及角膜厚度小于全厚 1/ 3、全角膜表面被纤维血管组织覆盖 ,或有广泛睑球粘连时 ,用羊膜移植联合自体角膜缘移植术治疗可受到促进角膜表面上皮愈合、抑制纤维血管化、改善角膜透明度、增进视力的较好效果。②眼表烧伤后角膜表层溃疡 ,应用羊膜移植术联合自体角膜缘移植术治疗效果较好。     

自体角膜缘联合羊膜移植治疗角膜缘障碍性眼表疾病

目的 评价自体角膜缘移植联合羊膜移植治疗角膜缘障碍性眼表疾病的临床疗效。方法 对单眼重度碱烧伤、热烧伤、蚕蚀性角膜溃疡等共计31例有角膜缘功能障碍的重症眼表疾病行自体角膜缘移植联合羊膜移植术。结果 术后观察12～36个月，29例获得稳定的眼表上皮，视力不同程度提高；2例角膜缘植片因缺血溶解，以角膜血管化告终。结论 自体角膜缘联合羊膜移植可有效治疗单眼角膜缘功能障碍性眼表疾病。     

深低温保存异体角膜缘干细胞羊膜移植治疗重度眼表疾病

目的 应用以羊膜为载体的深低温保存的角膜缘干细胞同种异体移植术治疗重度眼表疾病。方法 19例19眼重度眼表疾病患者采用羊膜移植联合深低温保存的角膜缘干细胞同种异体移植，2例术后半年行穿透性角膜移植术，随访观察术后疗效。结果 14例平均随访超过一年，眼表结构恢复正常，整个角膜上皮未见结膜杯状细胞，保存了眼球，视力均有不同程度的提高；1例植片脱落；4例发生角膜自溶的免疫排斥反应。结论 羊膜移植联合深低温保存的角膜缘干细胞同种异体移植术对于重度眼表疾病患者能快速、稳定的促进角膜表面重新上皮化，是一项可采纳的技术。     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

Histopathology of human corneas after amniotic membrane and limbal stem cell transplantation for severe chemical burn

PURPOSE: To describe the histopathologic changes in the cornea following amniotic membrane transplantation (AMT) combined with limbal transplantation. METHODS: Four eyes with complete limbal stem cell deficiency after severe chemical burn underwent AMT with either a living-related conjunctival limbal allograft (lr-CLAL) (three eyes) or a conjunctival limbal autograft (CLAU) (one eye) for ocular surface reconstruction. Penetrating keratoplasty was performed several months after the initial procedure for further visual rehabilitation. Mean follow up time was 20 months. Light and transmission electron microscopy (TEM) and indirect immunofluorescence microscopy of the excised corneal buttons were performed. RESULTS: All specimens displayed a multilayered epithelium without conjunctival goblet cells over the entire corneal surface. Basal epithelial cells demonstrated a firm connection to the remnants of the transplanted amniotic membrane (AM), which at some places appeared to be in a state of "modification" or "remodeling" in the collagen layers. The basement membrane zone displayed a positive staining when using antibodies against collagen IV and VII, integrin alpha6 and beta4, laminin 5, and bullous pemphigoid antigen 2. Remnants of the AM in the specimen showed staining of collagen IV, which was found also in cross-sections of cryopreserved AM. The recipients Bowman's membranes that were only partially present after the initial trauma were significantly disturbed. CONCLUSION: Within the time frame studied, the transplanted AM apparently survives and integrates into the host tissue being modified or remodeled by recipient cells. AMT in combination with a CLAU or lr-CLAL is a useful technique in promoting a rapid and stable reepithelialization of a corneal surface following severe chemical or thermal damage.     

Transplantation of amniotic membrane for conjunctival and corneal surface reconstruction

Summary The ocular surface epithelia with the tear film as a unit provide clear vision and comfort and serve as the first line of defense. It is important to understand how ocular surface health is maintained and how ocular surface failure occurs. Furthermore, it is timely to summarize new information concerning action mechanisms and clinical uses of amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. When appropriately processed and preserved, amniotic membrane as a native matrix can be used as a graft to restore conjunctival surfaces following removal of lesions such as pterygium, tumor, scar, symblepharon, and conjunctivochalasis. It can also be used as a graft to restore corneal surfaces suffering from limbal stem-cell deficiency. For partial limbal deficiency, amniotic membrane alone is frequently sufficient, while for total limbal deficiency it needs to be combined with limbal stem-cell transplantation with or without corneal transplantation. When used as a graft or patch, amniotic membrane can facilitate healing of persistent corneal ulcers and recurrent corneal erosion and reduce corneal haze following keratectomy. Reported data indicate that amniotic membrane transplantation facilitates rapid healing with recovery of a normal epithelial phenotype in the epithelium and reduces inflammation, vascularization, and scarring in the stroma.      

羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞移植治疗大鼠角膜碱烧伤的研究

目的研究人角膜缘上皮细胞的生物学特性,探讨体外培养的人角膜缘上皮细胞移植进行眼表重建的临床应用价值及前景。方法体外培养人角膜缘上皮细胞,通过免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）法分析表型,Brdu掺入法检测慢周期（slow—cycling）细胞。建立大鼠角膜碱烧伤模型,随机分为单纯对照组、羊膜移植（AMT）组及羊膜为载体的角膜缘上皮细胞移植（LSAT）组,术后通过裂隙灯显微镜观察、角膜切片HE染色及免疫荧光染色等方法对各组大鼠眼表恢复情况进行评价。结果培养早期大多数角膜缘上皮细胞p63和K19染色阳性,仅少数细胞K3染色阳性;随培养时间的延长,K3阳性细胞增多,部分细胞同时表达p63和K3。RT—PCR示培养的角膜缘上皮细胞中p63和K12均有阳性表达,而角膜上皮细胞仅表达K12。Brdu掺入法检测到慢周期细胞。动物实验表明,LSAT可以显著减轻角膜病变,使角膜恢复完整性和透明性,眼表评分各项指标与AMT组和对照组比较差异均有统计学意义。LSAT组大鼠角膜切片染色示大部分上皮细胞抗人核和K3染色阳性。结论体外培养的人角膜缘上皮细胞中p63不仅表达于角膜缘干细胞,在短暂扩充细胞中也有一定量的表达;慢周期细胞的存在证实了培养的角膜缘上皮细胞中角膜缘干细胞的存在,p63和K19阳性、K3阴性的细胞为角膜缘干细胞;羊膜为载体的体外培养的人角膜缘上皮细胞移植可有效重建眼表,具有较高的临床应用价值与发展前景。     

羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗

目的　探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法　在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月。其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气_液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损。进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察。结果　角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固。实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点。但眼睑闭合不全可导致手术失败。对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。结论　以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。     

羊膜移植重建眼表治疗角膜缘干细胞缺陷

目的 探讨羊膜移植(AMT)重建眼表治疗角膜缘干细胞缺陷(LSCD)的临床价值。方法12例14只眼分为轻、中、重3级,分别采用单纯AMT(3只眼)、AMT 角膜缘移植(LT)(6只眼)、AMT 带角膜缘的全板层角膜移植(5只眼)。结果 术后2～3周眼表全部上皮化。平均随访60周,所有病例眼表中央区透明、无血管及瘢痕生长,矫正视力13只眼有明显改善。结论 AMT是治疗LSCD伴基质损害的一种有效治疗手段,需联合LT或角膜移植者,可同时或先行AMT,待改善角膜缘基质微环境后,再施联合手术,以使提高手术成功率。其作用机制还需进一步研究。     

Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction

AIMS: To evaluate the efficacy of amniotic membrane transplantation (AMT) for ocular surface reconstruction. METHODS: 10 consecutive patients who underwent AMT were included. The indications were: group A, cases with persistent epithelial defect after corneal abscess (n = 1), radiation (n = 1), or chemical burn (n = 3); group B, cases with epithelial defect and severe stromal thinning and impending or recent perforation, due to chemical burn (two patients, three eyes) or corneal abscess (n = 2); group C, to promote corneal epithelium healing and prevent scarring after symblepharon surgery with extensive corneo-conjunctival adhesion (n = 1). Under sterile conditions amniotic membrane was prepared from a fresh placenta of a seronegative pregnant woman and stored at -70 degrees C. This technique involved the use of amniotic membrane to cover the entire cornea and perilimbal area in groups A and B, and the epithelial defect only in group C. RESULTS: The cornea healed satisfactorily in four of five patients in group A, but the epithelial defect recurred in one of these patients. After AMT three patients underwent limbal transplantation and one penetrating keratoplasty and cataract extraction. In group B amniotic membrane transplantation was not helpful, and all cases underwent an urgent tectonic corneal graft. Surgery successfully released the symblepharon, promoted epithelialisation and prevented adhesions in the case of group C. CONCLUSION: AMT was effective to promote corneal healing in patients with persistent epithelial defect, and appeared to be helpful after surgery to release corneo-conjunctival adhesion. Most cases required further surgery for visual and ocular surface rehabilitation. Amniotic membrane used as a patch was not effective to prevent tectonic corneal graft in cases with severe stromal thinning and impending or recent perforation.     

组织工程角膜片移植治疗无菌性角膜溃疡的实验研究

目的探讨组织工程角膜片治疗角膜溃疡的可行性及疗效。方法将16只新西兰大白兔制作成角膜溃疡模型,随机分为2组,每组8只,分别作单纯羊膜移植和以羊膜为载体的组织工程角膜片移植。术后进行大体观察、裂隙灯观察、组织学观察、扫描电镜观察。结果羊膜为载体组织工程角膜片移植治疗角膜溃疡,平均7.5周溃疡完全愈合,角膜恢复透明性和屈光性,较单纯羊膜移植组(平均9周)角膜溃疡修复快,效果好结论羊膜为载体构建的组织工程角膜片可以有效治疗角膜溃疡。     

新鲜羊膜移植治疗兔角膜碱烧伤的光镜和电镜观察

目的观察新鲜羊膜移植治疗兔角膜碱烧伤的组织学变化。方法21只（42眼）新西兰大白兔制作角膜碱烧伤模型；15只（30眼）为实验组，6只（12眼）为对照组；实验组行新鲜羊膜移植术，对照组不处理。分别取术后第1周、第2周、第4周的角膜进行光镜及电镜观察。结果术后第1周、第2周及第4周观察发现，对照组眼表面及角膜基质中有较多的炎性细胞浸润，上皮形状不规则，排列不整齐，第4周表现最明显；实验组炎性细胞浸润较少，上皮排列较整齐，显示新鲜羊膜有较强的抑制炎症并促进上皮生长的作用。通过透射电镜观察，发现新鲜羊膜移植组角膜上皮生长良好、表面有丰富的微绒毛、胶原纤维排列整齐，细胞间桥粒连接较多；对照组无上皮生长，胶原纤维排列紊乱。结论新鲜羊膜移植术在角膜碱烧伤治疗中有抑制炎症反应、促进上皮生长的作用，能够有效地促进角膜上皮的愈合及细胞之间的紧密连接。