淫羊藿苷与染料木黄酮对体外培养成骨细胞增殖及矿化成熟影响的对比研究

目的:对比研究淫羊藿苷( icariin,I)与染料木黄酮(genistein,G)对体外培养大鼠成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖与分化成熟的影响及其药理活性的强弱.方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养子含10％ FBS的MEM培养液中,3d后首次换液,铺满90％皿底后传代培养;I与G的作用终浓度为1×10-5 mol·L-1,增殖分析采用96孔板,MTT法分析;分化成熟分析采用24孔板,于成骨性诱导培养第3,6,9,12天分别测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素,第12天进行ALP组织化学染色、茜素红染色和钙化结节计数;于成骨性诱导培养0,6,12,24,48,72 h提取总RNA,Real-time RT-PCR法检测Runx-2,bFGF,IGF-I,Osterix( OSX)等成骨性相关因子的表达情况.结果:终浓度为1×10-5 mol·L-1的I与G均不促进ROB的增殖,均能显著提高细胞ALP活性、增加钙含量、促进骨钙素分泌,并增加钙化结节数量;同时上调Runx-2,bFGF,IGF-I和Osterix等成骨性相关因子的表达量;在成骨细胞水平上I促进ROB矿化成熟的药理学活性明显强于G的活性.结论:1×10-5 mol·L-1的I与G均能促进ROB矿化成熟,均有抗骨质疏松的作用,但在成骨细胞水平上I促进ROB矿化成熟的药理学活性显著强于G.     

淫羊藿苷与其代谢产物淫羊藿次苷Ⅱ对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响的比较研究

目的:研究淫羊藿苷与其主要代谢产物——淫羊藿次苷Ⅱ对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bonemarrow stromal cells,rBMSCs)成骨性分化的影响。方法:贴壁筛选法体外培养rBMSCs,以5×10-5mol/L的淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对rBMSCs的成骨性分化进行药物干预,比较淫羊藿苷组、淫羊藿次苷Ⅱ组和不加药的对照组之间碱性磷酸酶(ALP)活性、碱性磷酸酶阳性克隆数(CFU-FALP)、骨钙素分泌量、钙盐沉积量以及钙化结节数量的差异,RTReal-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的基因表达情况。结果:淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ均可显著增强rBMSCs的ALP活性,促进钙盐沉积和骨钙素的分泌,增加CFU-FALP和钙化结节数量,提高bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA水平,但淫羊藿次苷Ⅱ的活性明显高于淫羊藿苷。结论:淫羊藿次苷Ⅱ促进rBMSCs成骨性分化的活性高于淫羊藿苷,提示淫羊藿苷可以通过口服途径给药,其代谢物是发挥抗骨质疏松活性的主要成分。     

淫羊藿苷促进体外培养大鼠骨髓间 充质干细胞的成骨性分化

目的:研究淫羊藿苷对大鼠体外培养骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)成骨性分化的影响.方法:贴壁筛选法体外培养rBMSCs,采用1×10-5mol·L-1的淫羊藿苷进行药物干预,比较淫羊藿苷组和不加药的对照组之间碱性磷酸酶活性、碱性磷酸酶阳性克隆数(CFU-FALP)及钙化结节数量,提取总RNA,RT Real-time PCR检测bFGF,IGF-1,Osterix(OSX),Runx-2 mRNA的表达情况.结果:1×10-5mol·L-1淫羊藿苷可提高碱性磷酸酶(ALP)活性,增加钙化结节和CFU-FALP数量,促进与成骨性分化相关因子bFGF,IGF-1,OSX,Runx-2 mRNA的表达.结论:淫羊藿苷可显著促进rBMSCs的成骨性分化,提示淫羊藿苷具有开发为抗骨质疏松或促进骨折愈合新药的潜力.     

蛇床子素对体外培养成骨细胞成骨相关因子表达的影响

目的:研究蛇床子素(Osthol)对体外培养大鼠成骨细胞(Rat calvarial osteoblasts,ROB)成骨相关因子表达的影响。方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,传代之后进行成骨性诱导培养并加药干预,蛇床子素浓度为1×10-5mol/L,于成骨性诱导培养0、6、12、24、48和72小时提取总RNA,RT-Real Time PCR法检测Runx-2、bFGF、IGF-Ⅰ和Osterix(OSX)等成骨性相关因子的表达情况;第3、6、9、12天分别测钙盐沉积量和骨钙素分泌量。结果:1×10-5mol/L的蛇床子素能够显著提高ROB的Runx-2、bFGF、IGF-Ⅰ、Osterix基因的表达量,并促进骨钙素的分泌和钙盐沉积,从而增强细胞成骨性活动。结论:蛇床子素能促进ROB的矿化成熟并增强细胞成骨性活动,是促进骨修复愈合及抗骨质疏松的重要原因之一。     

淫羊藿苷含药血清对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨性分化的影响

目的:研究淫羊藿苷含药血清(SI)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)增殖和成骨性分化的影响。方法:以每0.25g/kg质量淫羊藿苷的剂量灌服成年大鼠,制得淫羊藿苷含药血清,以灌服等体积生理盐水制得对照血清。分别以2.5%,5%和10%3种血清浓度干预rBMSCs,MTT法检测细胞增殖率,同时检测成骨性诱导培养9d后的碱性磷酸酶(ALP)活性,筛选出最佳血清浓度。以最佳血清浓度干预rBMSCs的成骨性分化,比较SI组和对照组之间的钙盐沉积量、骨钙素分泌量;提取Total RNA,RT-PCR检测IGF-1,Runx-2与Osterix mRNA的表达情况。结果:所有浓度的含药血清均能抑制rBMSCs的增殖,但可提高ALP活性。5%的SI浓度为最佳干预浓度,该浓度的含药血清可显著促进骨钙素的分泌和钙盐沉积,提高ALP活性,增强IGF-1,Runx-2与Osterix mRNA的表达。结论:淫羊藿苷经口服后的代谢产物抑制rBMSCs增殖,但可促进成骨性分化,提示淫羊藿苷可以通过口服途径给药,其代谢物是发挥抗骨质疏松活性的主要成分。     

异补骨脂素对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化成熟的影响

目的:研究异补骨脂素(Isopsoralen,IP)对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖与分化成熟的影响。方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3 d后首次换液,铺满90%皿底后传代培养;增殖分析采用96孔板,加入在培养液中终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L的异补骨脂素,MTT法分析;分化分析采用24孔板,于成骨性诱导培养第3、6、9、12、15天分别测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性、钙含量、骨钙素,第12天进行ALP组织化学染色,第14天进行茜素红染色和钙化结节计数。结果:终浓度为1×10-4mol/L的异补骨脂素对细胞增殖有抑制作用,而1×10-5mol/L浓度虽对ROB增殖无明显影响,但能显著提高细胞ALP活性、增加钙含量、促进骨钙素分泌,并增加钙化结节数量。结论1×10-5mol/L异补骨脂素能促进ROB分化成熟,应为中药补骨脂抗骨质疏松的有效成分。     

淫羊藿素和脱水淫羊藿素对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响的比较研究

 目的 比较研究淫羊藿素和脱水淫羊藿素对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow stromal cells,rBMSCs成骨性分化的影响。方法 贴壁筛选法体外培养rBMSCs,以1×10-5 mol·L-1的淫羊藿素和脱水淫羊藿素对rBMSCs的成骨性分化进行药物干预,比较淫羊藿素组、脱水淫羊藿素组以及不加药的对照组之间碱性磷酸酶（ALP活性、ALP阳性克隆数（colonies stained positive for alkaline phosphatase,CFU-F_ALP、骨钙素分泌量、钙盐沉积量以及钙化结节数量的差异,Real Time RT-PCR法检测IGF-1、Osterix和Runx-2的基因表达情况。Western-blot法检测Ⅰ型胶原蛋白的分泌量。结果 淫羊藿素可显著增强rBMSCs的ALP活性,促进钙盐沉积和骨钙素的分泌,增加CFU-F_ALP和钙化结节数量,提高IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA水平,同时也可增强Ⅰ型胶原蛋白的分泌,而脱水淫羊藿素并未表现出类似效应。结论 淫羊藿素促进rBMSCs成骨性分化的活性显著高于脱水淫羊藿素,可能是二者异戊烷链上的构型差异,导致淫羊藿素的生物活性强于脱水淫羊藿素,提示我们可以通过对药物进行化学结构的改造,增强药效,降低毒性,从而研究开发出新型抗骨质疏松药物。     

柚皮苷对体外培养乳鼠颅骨成骨细胞增殖和分化成熟的影响

目的:研究柚皮苷对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖和分化成熟的影响.方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法培养ROB,每3d换液1次,铺满80％皿底后传代培养.采用终浓度分别为1×10-4,1 ×10-5,1 ×10-6,1×10-7 mol·L-1的柚皮苷进行药物干预,MTT法检测细胞增殖率,同时检测成骨性诱导培养9d后的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,筛选出最佳浓度.以最佳药物浓度干预ROB的分化成熟,比较柚皮苷组和不加药的对照组之间的骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(oesteopontin,OPN)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)的分泌量;提取总RNA,Real-time RT-PCR检测bFGF,IGF-1,Runx-2,Osterix,ERα和ERβ的mRNA水平;Westernblot法检测ERα,ERβ和Ⅰ型胶原蛋白的表达量;并用雌激素竞争性抑制剂ICI 182.780进行阻断,观察阻断前后各指标的变化情况.结果:柚皮苷剂量依赖性刺激成骨细胞的增殖,并可强烈促进ROB的分化成熟.最佳药物浓度为1×10-5 mol·L-1,该浓度下的柚皮苷可明显提高OC,OPN和BMP-2的分泌量,促进与成骨相关的因子bFGF,IGF-1,Runx-2,Osterix和雌激素受体基因ERα及ERβmRNA的表达,同时也可增强ERα,ERβ和Ⅰ型胶原蛋白的分泌,但以上效果均可被阻断剂ICI 182.780所抑制.结论:浓度为1 ×10-5mol·L-1的柚皮苷可显著促进ROB的增殖与分化成熟,并且该促进效果会被雌激素通路阻断剂ICI 182.780所抑制,表明柚皮苷属于植物雌激素,通过雌激素信号通路发挥其促骨形成活性,可以用于骨质疏松症的防治.     

淫羊藿苷对骨髓间充质成骨性活性强于金雀异黄酮

目的:比较研究金雀异黄酮与淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞(rats bone marrow stromal cell,rBMSC)成骨性分化的影响.方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质细胞,筛选最佳的药物浓度;采用终浓度为1×10-5mol·L-1的金雀异黄酮和淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞进行干预;在药物干预后的第3,6,9,12,15天后测定碱性磷酸酶活性(alkaline pbosphatase,ALP)和3,6,9,12,15 d测定钙含量;第12天进行钙化结节茜素红染色;在药物干预后第12,24,48,72,96 h Real-time RT-PCR检测OXS,Runx-2,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP-2)和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平.结果:浓度为1 ×10-5 mol·L-1金雀异黄酮和淫羊藿苷可提高ALP活性最高,增加Ca含量,调节骨代谢活性Runx-2,OXS,BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平,淫羊藿苷比金雀异黄酮的成骨性作用更强一些.结论:在促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化作用方面淫羊藿苷较强于金雀异黄酮.     

淫羊藿苷对体外培养乳鼠颅骨成骨细胞增殖、分化及成熟的影响

目的:研究淫羊藿苷对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(Rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖和分化成熟的影响。方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法培养ROB,每3 d换液1次,铺满80%皿底后传代培养。采用终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L的淫羊藿苷进行药物干预,MTT法检测细胞增殖率,同时检测成骨性诱导培养9 d后的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性,筛选出最佳浓度。以最佳药物浓度干预ROB的分化成熟,比较淫羊藿苷组和不加药的对照组之间的钙化结节数量及碱性磷酸酶阳性克隆数(coloniesstained positive for alkaline phosphatase,CFU-FALP);提取总RNA,Real Time RT-PCR检测Runx-2与Osterix mRNA的表达情况;Western-blot法检测Ⅰ型胶原蛋白的分泌量。结果:淫羊藿苷剂量依赖性抑制细胞的增殖,但可强烈促进ROB的分化成熟,最佳药物浓度为1×10-5mol/L。该浓度下的淫羊藿苷可显著增加钙化结节和CFU-FALP数量,促进与...     

老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

目的:观察老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并对成骨分化过程中相关基因表达进行检测。方法:分离、培养小鼠BMSCs,加入不同浓度老鹳草素(1×10-9,1×10-8,1×10-7mol·L-1)培养,另设空白组,分别于成骨诱导第7,14天采用碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OCN)试剂盒测定ALP活性及OCN含量,并进行ALP染色。于成骨诱导第21天时采用茜素红染色检测成骨分化过程中钙结节形成数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测BMSCs成骨分化过程中OCN,ALP,骨涎蛋白(BSP),Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA和蛋白表达的变化。结果:与空白组比较,成骨诱导后第7,14天时,老鹳草素各剂量组ALP活性,OCN含量及ALP染色强度均明显升高(P0.05),成骨诱导第21天时,老鹳草素各剂量组矿化结节数量及OCN,ALP,BSP,Runx2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.05)。结论:老鹳草素能够明显促进BMSCs向成骨方向分化,成骨相关基因OCN,ALP,BSP,Runx2均参与这一过程。     

金雀异黄酮对体外培养缺氧大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

 目的 观察金雀异黄酮对缺氧体外培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖与成骨分化的影响。方法 采用贴壁筛选法体外培养BMSCs并用三气培养箱建立缺氧模型。设常氧对照组、缺氧对照组和缺氧加药组,其中缺氧加药组细分为1×10-8、1×10-7和1×10-6 mol·L-1组金雀异黄酮组,缺氧处理36 h后分析各组的细胞增殖和成骨性指标包括碱性磷酸酶（ALP）活性、Ⅰ型胶原表达、钙盐沉积量和钙化结节面积等,并用Real Time RT-PCR法检测Runx2和骨形成蛋白（BMP）-2的基因表达情况。结果 与缺氧对照组比较,金雀异黄酮抑制BMSCs增殖,显著提高ALP活性、Ⅰ型胶原表达量、钙盐沉积量和钙化结节面积,并提高基因Runx2和BMP-2的表达水平,且呈现出剂量依赖性特点。结论 金雀异黄酮具有抑制缺氧BMSCs增殖并促进其成骨分化的作用。     

17β-雌二醇对骨髓基质细胞成骨、成脂分化和成骨细胞成脂横向分化的影响

 目的研究17β-雌二醇对小鼠原代骨髓基质细胞成骨、成脂分化以及小鼠原代成骨细胞成脂横向分化的影响。方法四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测17β-雌二醇对骨髓基质细胞和成骨细胞增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性测定法检测17β-雌二醇对骨髓基质细胞成骨分化的影响,油红O染色形态学及定量测定法检测17β-雌二醇对骨髓基质细胞成脂分化和成骨细胞成脂横向分化的影响。结果1×10^-8,1×10^-7,5×10^-7,1×10^-6,5×10^-6和1×10^-5mol·L^-1的17β-雌二醇可以促进小鼠原代骨髓基质细胞和成骨细胞增殖(P<0.05);5×10^-7,1×10^-6,5×10^-6和1×10^-5mol·L^-1的17β-雌二醇促进骨髓基质细胞的成骨分化、抑制成脂分化,但是浓度为1×10^-7mol·L^-1的17β-雌二醇抑制骨髓基质细胞的成骨分化、促进成脂分化(P<0.05);浓度为1×10^-8,5×10^-7,1×10^-6,和1×10^-5mol·L^-1的17β-雌二醇抑制成骨细胞的成脂分化(P<0.05)。结论17β-雌二醇可以调节骨髓基质细胞向成骨细胞分化而减少其向脂肪细胞分化,并且可以抑制成骨细胞向脂肪细胞的横向分化。     

金叶子异槲皮苷对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

该研究对从金叶子中分离得到的异槲皮苷的成骨活性进行了系统评价。在1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7mol·L-1异槲皮苷浓度作用下检测了MC3T3-E1细胞增殖活力和碱性磷酸酶活性;在异槲皮苷作用的第3天对MC3T3-E1碱性磷酸酶、I型胶原以及转录因子Runx2和Osterix的基因表达水平进行了检测;并通过茜素红染色的方法在第21天对MC3T3-E1进行了胞外基质矿化能力的评价。结果显示,异槲皮苷在1×10-7~1×10-5mol·L-1能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及矿化能力,上调成骨相关基因的表达,而且该作用呈现出一定的浓度依赖性,在浓度为1×10-6mol·L-1时促进作用最强。在1×10-4mol·L-1时表现出明显的细胞毒性。因此,从金叶子中分离得到的异槲皮苷有一定的成骨活性,这可能是传统中药金叶子治疗骨折的主要药效成分。