结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的探索增强结核杆菌DNA疫苗有效性的新方法，为研制并开发新一代高效结核杆菌DNA疫苗奠定基础。方法分别构建结核杆菌Ag85A抗原基因真核表达质粒及其与小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的真核嵌合表达质粒，体外转染COS7细胞检测两种重组质粒的表达活性后，将其分别用作DNA疫苗给BALB／c小鼠肌内注射，检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标，同时进行动物免疫保护性实验，比较分析两种DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因与小鼠粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的嵌合DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性明显强于Ag85A抗原基因非嵌合DNA疫苗，但两种DNA疫苗的免疫保护性无明显差异。结论粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合DNA疫苗能显著增强结核病DNA疫苗的免疫原性。     

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

结核分支杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的构建及其在小鼠体内的表达

我们将结核杆菌Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头 ,经过基因拼接 (geneSOEing)法融合构建DNA疫苗并研究其免疫原性 ,为进一步研究其融合基因疫苗的免疫保护作用奠定基础。材料与方法　H3 7Rv购自中国医学科学院微生物菌种保藏中心 ,重组Ag85B和MPT64纯化蛋白及多价抗血清由本教研室收藏。纯化蛋白衍生物 (PPD )标准品由成都生物制品研究所提供。BABL/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。根据H37Rv标准菌株Ag85B和MPT64的编码序列 ,设计引物。P1:5′ AAGCTTATGTTCTCCCGGCCGGG 3′为Ag85B上游引物 ,下划线部分…     

传统BCG初免IL-12联合Ag85A DNA疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察

目的 探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法 实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强免疫组、以及BCG初免pcDNA3.1加强免疫组。按BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA加强的免疫程序进行免疫实验,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测对小鼠的免疫效果。结果 采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖,加强免疫后IFN-γ水平、IL-2水平、IL-4水平BCG/ Ag85A+IL-12组在3个时间段分别为128.2±20.4、190.2±16.51、244.2±39.14;146.2±17.29、271.6±16.36、419.3±28.12;68.6±6.62、96.6±5.5、117.4±10.71均高于其它各组(P<0.05)。结论 采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫能明显增强机体体液和细胞免疫,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了依据。     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究

目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB／c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平（ELISA）和体外循异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL－2、IL－4、IL－10、IFN－γ表达水平。结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效介明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL－2和IFN－γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL－4和IL－10 mRNA转录水平在3组中无明显变化。结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫。     

携带结核杆菌Ag85B靶细胞的构建、鉴定及应用

目的构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的靶细胞以便评定结核疫苗的特异性细胞毒(CTL)作用。方法将携带有Ag85B基因的重组质粒pTB30s转入小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),用RT-PCR及免疫组化染色法鉴定阳性克隆细胞胞内的Ag85B基因转录和蛋白表达水平;同时,用接种过BCG,pTB30s或生理盐水(NS)小鼠脾脏单个核细胞作为效应细胞,G418高压筛选的阳性克隆细胞为靶细胞,用MTT法检测各组CTL杀伤活性。结果RT-PCR以及免疫组化结果显示,阳性细胞能稳定表达Ag85B。CTL杀伤实验:BCG、pTB30s及NS对照组杀伤率分别为28.14%、45.18%和5.13%。结论含有Ag85B靶细胞构建成功及应用,为研究结核疫苗的免疫效果提供了较好的研究手段。     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B基因真核共表达载体的构建与表达

目的 Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要优势保护抗原,为提高编码Ag85A和Ag85B DNA疫苗的免疫原性和免疫效果,特构建真核共表达Ag85A和Ag85B抗原的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,并利用293T细胞对其表达进行检测.方法 PCR扩增Ag85A和Ag85B基因,逐步将Ag85A和Ag85B基因定向插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加A信号BGH poly(A)之间,并将Ag85A和Ag85B基因以内部核糖体进入位点(internal ribo some entry site,IRES)序列连接,酶切和测序验证后将重组质粒转染至293T细胞中进行真核表达,48 h后提取细胞总蛋白,表达产物经SDS-PAGE分离和Western blot分析.结果 限制性内切酶酶切及测序结果表明,重组质粒pcDNA-Ag85AIRES-Ag85B基因序列和阅读框架正确.将重组质粒转入293T细胞后,利用Ag85A和Ag85B特异性抗体Western blot检测证实两种抗原可在同一载体中各自独立表达.结论 成功构建了能够同时独立表达结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B抗原基因的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,为下一步研究它们的免疫原性和免疫效果奠定了基础.     

Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的　研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法　C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1( )、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果　PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)C     

结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2的安全性评价研究

目的评价结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内的安全性。方法小鼠慢性毒性实验:C57BL/6J小鼠间隔2周、皮下3次注射100 μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50 μg),观察临床症状表现和器官病理学改变。小鼠急性毒性实验:C57BL/6J小鼠皮下注射100 μg 亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50 μg),观察小鼠临床症状、体重、摄食摄水量、器官的脏器系数和病理学表现。豚鼠全身过敏实验:Hartley豚鼠间隔2 d、皮下3次注射1 000 μg、100 μg、10 μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2均按质量1∶1混合),16 d后用二倍剂量足背静脉注射激发,观察体重变化和全身过敏症状。结果小鼠慢性毒性实验表明,亚单位疫苗多次注射后不引起临床症状和病理损伤;小鼠急性毒性实验表明,亚单位疫苗对小鼠不产生临床症状,对小鼠体重、摄食摄水量、脏器系数、器官病理学改变影响无统计学意义;豚鼠全身过敏实验表明,疫苗短期多次致敏对豚鼠的体重无明显影响,低剂量疫苗不引起豚鼠产生全身过敏反应。结论亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内均表现出良好的安全性,可用于进一步TB预防和治疗性疫苗的研制。     

结核分枝菌Ag85B DNA疫苗免疫对小鼠结肠SIgA及菌群的影响北大核心CSCD

目的 探究结核分枝杆菌Ag85B的真核表达质粒pcD-Ag85B经肌肉免疫后对小鼠结肠黏膜SIgA及菌群的影响。方法 以pcDNA3.1+为真核表达载体,将信号肽基因和编码Ag85B的Rv1886c基因共963 bp核苷酸序列连接到pcDNA3.1+,构建真核表达质粒pcD-Ag85B。通过双酶切和测序鉴定无误后,将pcD-Ag85B重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)并验证其表达。采用微针注射法将pcD-Ag85B重组质粒经大腿肌肉免疫C57BL/6J小鼠;初免后42 d收集小鼠粪便及结肠黏液进行16S RNA高通量测序和菌群结构分析,并测定SIgA特异性抗体效价。结果 成功构建真核表达质粒pcD-Ag85B并检测到Ag85B蛋白的特异性表达,蛋白相对分子质量约为35×10~3,与预期相符。一免疫后42 d,Ag85B组小鼠结肠厚壁菌门-乳杆菌属的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)丰度与对照组相比显著增高(均P<0.05);肠粘膜SlgA效价为1∶4500。结论 成功获得表达Ag85B蛋白的真核表达质粒,用该质粒免疫能诱导小鼠结肠粘膜产生体液免疫效应,改善结肠益生菌-乳酸杆菌群丰度。     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病疗效的实验研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病的效果。方法用结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉注射50只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为5组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、草分枝杆菌F.U.36注射液(D组)、Ag85A/B嵌合DNA疫苗(E组)治疗,每2周肌肉注射1次DNA疫苗,共3次。在治疗结束后2周,杀鼠,取小鼠肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果与A组比较,D组、E组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰,细胞分布均匀。与A组相比,C、D、E组肺脏菌落数依次减少2.11 log、0.76 log、0.81 log;肝脏菌落数依次减少2.11 log、0.74 log、1.11 logs(P0.01)。结论 Ag85A/B嵌合DNA对小鼠敏感结核病具有较好的治疗效果。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一。将本课题组自1998年至今研究Mtb Ag85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。