干扰素-α诱导HepG2 2.2.15细胞APOBEC3G的表达及其机制

目的 探讨干扰素(IFN)-α刺激HepG2 2.2.15细胞后,对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G,APOBEC3G)表达的影响,以及初步探讨Ja-nus激酶-信号传导和转录激活子(JAK-STAT)信号通道是否参与APOBEC3G基因转录调控.方法 对HepG22.2.15细胞给予不同剂量(0、1、101、102、103、104 U/mL)IFN-α刺激8 h时,以及10U/mL IFN-α刺激2、4、6、8、10、12 h时,收集细胞或培养上清液.应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测HepG2 2.2.15细胞APOBEC3G、STAT-1 mRNA及蛋白的表达水平.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原与e抗原(HBsAg与HBeAg)水平,应用实时荧光定量PCP及RT-PCR分别检测上清液中HBV DNA水平以及细胞中HBV mRNA水平.结果 无IFN-α(O U/mL)刺激时,HepG2 2.2.15细胞APOBEC3G表达水平很低.随着IFN-α浓度的升高,APOBEC3G mRNA及蛋白水平逐步升高,IFN-α浓度为104U/mL时,APOBEC3G表达量最高,并且STAT-1分子mRNA及蛋白的表达量亦逐步升高,与APOBEC3G表达量呈现平行相关.随着IFN-α刺激时间的延长,APOBEC3G表达量明显升高,8 h时达到最高,其后逐渐下降.104 U/mL-α刺激8 h时,HepG2 2.2.15细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA及细胞中HBV mR-NA水平均明显低于无IFN-α刺激的HepG2 2.2.15细胞.结论 IFN-α能诱导HepG2 2.2.15细胞表达APO-BEC3G,在一定范围内,APOBEC3G的表达与IFN-α的剂量、作用时间呈正相关;IFN-α诱导APOBEC3G的表达可能是其发挥抗病毒作用的机制之一;IFN-α是否经JAK-STAT信号通道刺激APOBEC3G的表达,二者之间的关系及其机制尚待进一步研究.     

白介素4对乙型肝炎病毒体外复制和表达的影响

目的 探讨IL-4对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg及HBV DNA复制的抑制作用,认识Ⅱ-4在抗HBV感染中的作用.方法 通过MTT比色法检测不同浓度重组IL-4(rIL-4)对HepG2.2.15细胞的细胞毒性作用,用ELISA检测rIL-4对HepG2.2.15细胞不同时相HBsag和HBeAs分泌的作用,用实时荧光定量PCR检测rIL-4对HBV DNA合成的影响.结果 rIL-4的各浓度对HepG2.2.15细胞无细胞毒性作用;rIL-4处理HepG2.2.15细胞后,不同浓度组HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量在96 h的差异具有统计学意义(P＜0.05),但rIL-4的浓度低于100ng/mL的各组,HBsAg和HBV DNA含量在处理48 h时,各组间无明显差异(P＞0.05).此抑制作用随rIL-4浓度的增加而增强.结论 rIL-4在体外有直接的抗HBV作用.     

化疗药物对肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15表达TLR2、TLR4的影响

目的 观察氟尿嘧啶和顺铂对肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15表达Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)的影响.方法 用直接免疫荧光流式细胞术检测加入不同终浓度的氟尿嘧啶和顺铂后24、48和72 h HepG2和HepG2.2.15细胞表达TLR2和TLR4的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率.结果 HepG2.2.15细胞上TLR2和TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(P＜0.01),但加入不同终浓度的氟尿嘧啶和顺铂后,HepG2和HepG2.2.15细胞表达TLR2和TLR4的MFI及阳性细胞率均基本无变化,仅在100、200 μg/ml的氟尿嘧啶和20μg/ml的顺铂作用72 h后,HepG2.2.15细胞表达TLR2的MFI低于空白对照组(P＜0.05).结论 体外实验显示在肝癌细胞中经典化疗药物氟尿嘧啶和顺铂不能激活TLR2和TLR4信号途径,要通过激活TLR2和TLR4信号途径而达到对抗肝癌细胞的作用,需要寻找其他的方式.     

siRNA沉默HBx基因对HepG2.2.15细胞MMP-9表达的影响

目的利用siRNA技术探讨HBx基因沉默对肝癌细胞HepG2.2.15中MMP-9表达的影响。方法将针对HBx基因的干扰质粒载体pSIHBV/X转染肝癌细胞HepG2.2.15,用Real-time PCR法检测HBx与MMP-9 mRNA表达;Western blot方法检测MMP-9蛋白表达。结果 Real-time PCR检测结果显示,转染24 h、48 h、72 h后实验组HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA相对表达水平分别为121.13±8.72、83.17±7.93、56.33±6.17,与对照组相比(137.28±12.33)差异有统计学意义(P0.01);24 h、48 h、72 h实验组HepG2.2.15细胞中MMP-9基因mRNA相对表达水平分别为83.27±6.17、69.37±8.26、58.18±4.77,与对照组相比(131.27±16.28)差异有统计学意义(P0.01);Western blot检测结果表明,24 h、48 h实验组HepG2.2.15细胞中MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.357±0.025、0.218±0.051,与对照组相比(0.475±0.073)差异有统计学意义(P0.05)。结论利用HBx siRNA干扰质粒沉默HepG2.2.15细胞中HBx基因表达,可下调与肿瘤细胞迁移相关的MMP-9基因mRNA水平和蛋白水平的表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白在促进肝细胞衰老中的作用

目的探讨乙型肝炎病毒通过乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝细胞衰老的影响。方法对HepG2.2.15细胞、HBx沉默HepG2.2.15细胞(HepG2.2.15-HBx-si)及HBx过表达HepG2细胞(HepG2-HBx)进行β-半乳糖苷酶染色,采用Western Blot对肝细胞衰老相关蛋白进行检测;对比分析HBx对肝细胞衰老的影响。结果β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例:HepG2.2.15组为(0.480±0.096),HepG2组为(0.016±0.005),两组比较差异有统计学意义(P0.001);HepG2.2.15-HBx-si组为(0.278±0.065),对照组HepG2.2.15-HBx-nc组为(0.329±0.044),两组比较差异无统计学意义(P=0.092);HepG2-HBx组为(0.319±0.033),对照组HepG2-HBx-con组为(0.064±0.012),两组比较差异有统计学意义(P0.001)。Western Blot检测肝细胞衰老蛋白:HepG2.2.15组和HepG2-HBx组肝细胞衰老相关蛋白p53及p21表达量均高于其对照组,HepG2.2.15-HBx-si组肝细胞衰老相关蛋白p53及p21表达量低于HepG2.2.15-HBx-nc组。结论乙型肝炎病毒可通过HBx促进肝细胞衰老。     

靶向HBx小干扰RNA表达载体构建及其功能探讨

目的:设计和构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx)特异性的小干扰RNA(siRNA)体内表达载体,筛选抑制X基因表达的有效siRNA,并初步探讨其对HBV复制功能的影响。方法:以X基因为目的基因,以产生siRNA质粒载体pSilencerTM-U6为表达模板,细胞内转录合成3条siRNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-HBx。将重组质粒载体plucF-HBx与产生siRNA的质粒pSilencerTM-U6共转染HepG2细胞,检测荧光素酶活性以筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA,逆转录聚合酶链反应检测HBx mRNA的表达,进一步证实siRNA对HBx表达的抑制效果,然后将siRNA转染HepG2.2.15,酶联免疫吸附法和荧光定量PCR检测siRNA对HBV复制的影响。结果:合成的3条siRNA中有1条抑制荧光素酶表达,抑制效率为76.3%,并能特异性抑制HBV的复制。结论:成功构建并筛选到针对X基因表达的有效siRNA质粒,为HBV的基因治疗奠定基础。     

EGCG对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响及可能的分子机制。方法不同浓度EGCG对HepG2细胞进行干预后,CCK-8法检测EGCG对肝癌HepG2细胞增殖的影响;荧光显微镜及流式细胞术(FCM)Annexin V-FITC/PI双染法检测EGCG对HepG2细胞的凋亡诱导作用;Transwell侵袭实验检测EGCG对HepG2细胞侵袭的影响;ELISA法检测HepG2细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果EGCG各浓度组干预HepG2细胞24、48h后,细胞的生长增殖均明显受到抑制,其24h IC25值和IC50值分别为58.19和133.90mg/L。以60、135mg/L EGCG干预肝癌HepG2细胞24h后,FCM结果显示药物组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05),荧光显微镜观察显示随着药物浓度的增加,细胞凋亡程度加重。Transwell侵袭实验显示,60、135mg/L EGCG对HepG2细胞侵袭力抑制率分别为69.47%和100%(P<0.05)。ELISA检测结果显示,EGCG干预后HepG2细胞上清液中MMP-2和VEGF表达水平下降(P<0.05)。结论 EGCG对人肝癌HepG2细胞具有抑制增殖和侵袭作用,其机制可能与EGCG诱导HepG2细胞凋亡和抑制肿瘤细胞中MMP-2及VEGF表达水平有关。     

六溴环十二烷对视黄醛类X受体α、孕烷X受体、过氧化物酶体增殖物活化受体γ的影响及其相互作用

目的探讨六溴环十二烷(HBCDs)对小鼠神经母细胞瘤细胞N2a增殖的影响以及对3个重要细胞核受体:视黄醛类X受体α(RXRα)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、孕烷X受体(PXR)表达及其相互作用的影响。方法用不同浓度的3种非对映异构体(±)α-HBCD,(±)β-HBCD,(±)γ-HBCD处理N2a细胞,Cell counting kit-8(CCK-8)法检测HBCD对N2a的细胞毒性作用;流式细胞术检测HBCD对N2a细胞周期的影响;实时荧光定量(RT-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot,WB)法分别用于检测3个细胞核受体RXRα、PPARγ、PXR和下游靶基因细胞色素P450亚酶CYP3A11的mRNA及蛋白表达水平的变化;免疫共沉淀技术分析RXRα、PXR、PPARγ受体间的相互作用。结果β-HBCD对N2a的细胞毒性明显大于α-HBCD,γ-HBCD没有明显的细胞毒性。α-HBCD、β-HBCD对N2a细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量效应关系(P0.05),其半数抑制浓度(IC_(50))分别为60.07和10.52μmol/L,γ-HBCD的细胞毒性较小,镜下可见黑色絮状物,CCK-8法未能测定出其IC_(50);α-、β-HBCD会使细胞周期阻滞在G2/M期;染毒24 h后,RXRα、PPARγ、PXR及CYP3A11的mRNA及蛋白表达水平均呈现上升趋势(P0.05);在N2a细胞内,α-HBCD染毒前后,RXRα与PPARγ、PXR之间始终存在交互作用关系。结论α-HBCD、β-HBCD对N2a细胞具有增殖抑制作用,细胞周期主要阻滞在G2/M期。α-HBCD、β-HBCD均可诱导3种细胞核受体RXRα、PPARγ和PXR的表达升高,PXR受体下游表达基因CYP3A11的表达也明显升高(P0.05)。RXRα与PPARγ、PXR三个细胞核受体之间始终存在交互作用,但是受体间相互作用的分子机制有待深入研究。     

全反式视黄酸调控乳腺癌细胞的增殖及机制研究

目的研究全反式视黄酸(ATRA)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及ATRA与X射线照射对视黄醇类X受体α(RXRα)表达水平的影响。方法 MTT法检测细胞增殖,Western blot检测RXRα表达水平。结果 ATRA浓度在100～1000 nmol/L,72 h可抑制细胞的增殖。观察不同时间100 nmol/L的ATRA作用,24 h内,促进MDA-MB-231细胞的增殖,而作用48 h后,可抑制细胞的增殖。ATRA在100～1000 nmol/L范围内可诱导RXRα的表达,且存在浓度依赖性。100 nmol/L的ATRA作用24 h即可诱导RXRα的表达,并且存在时间依赖性。X射线照射未能诱导RXRα的表达。结论 100～1000 nmol/L的ATRA作用48 h即可抑制MDA-MB-231细胞增殖,且其对MDA-MB-231细胞RXRα蛋白表达存在浓度和时间依赖性,为ATRA用于临床乳腺癌的治疗提供了理论基础,也提示RXRα可能是ATRA抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。     

雌激素受体α对胆汁酸转运相关基因的调控及其与孕鼠肝内胆汁淤积症发生的相关性

目的探讨雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)对参与调节胆汁酸转运相关的基因,如法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)、钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate co-transprorting polypeptide,NTCP)、胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)的调控作用及其对孕鼠肝内胆汁淤积发生的影响。方法将40只SPF级SD孕鼠随机均分为4组。自孕第15 d起,对照组颈部皮下注射精制植物油2.0 m L/kg·d;低、中、高剂量组分别皮下注射17α-乙炔雌二醇1.0 mg/kg·d、1.25 mg/kg·d、1.5 mg/kg·d。于妊娠第21 d采血2 m L,后采用颈部脱臼法处死,提取母鼠肝脏行活体组织学检查。检测各组孕鼠血清中的生化指标及肝脏组织中各目的蛋白和mRNA表达量。结果生化指标:低、中、高剂量组孕鼠各蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),低、中、高剂量组组间比较,差异有统计学意义(P0.05);蛋白表达及mRNA的表达水平:ER在对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的表达量依次升高,而FXR、NTCP、BSEP在对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的表达量依次降低,各组目的基因表达量与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论随着雌激素剂量的增加,ERα表达水平升高,而FXR、NTCP、BSEP表达水平均降低,提示胆汁酸代谢转运功能降低,可能为雌激素诱导孕鼠肝内胆汁淤积的发生机制之一。     

反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究

目的 探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒（HBV）感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。方法 用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸（AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道。以HBV DNA转染的HepG2．2．15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况。结果 当AsON的最佳作用浓度为10μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为;57％、60％、52％和56％、45％、56％,AsON对HBV抗原的凶制作用具双峰现象。无关序列无明显抑制作用（＜12％）。利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40μmol/L时,对细胞代谢无毒副作用。结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌。     

Inhibition of intestinal tumorigenesis in Apc(min/+) mice by green tea polyphenols (polyphenon E) and individual catechins

In this work, we compared the cancer preventive activities of Polyphenon E (PPE), a standardized green tea polyphenol preparation given in diet versus drinking fluid as well as the activities of PPE versus individual catechins. We treated Apc(Min/+) mice for 9 wk with 0.08% (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), 0.08% (-)-epicatechin-3-gallate, or 0.12% PPE in drinking fluid or diet. Only 0.12% dietary PPE and 0.08% EGCG in drinking fluid significantly decreased tumor multiplicity (70% and 51%, respectively). Compared to PPE in drinking fluid, dietary PPE delivered twofold more EGCG to the small intestine. Immunohistochemistry showed that adenomas in groups treated with PPE and EGCG had decreased cell proliferation, Beta -catenin nuclear expression, and phospho-Akt levels; higher cleaved caspase-3 levels, and partially restored retinoid X receptor alpha expression. The results suggest that these molecular events contribute to the cancer prevention activity of EGCG and PPE. Furthermore, diet appears to be a better route of administration for PPE than drinking fluid.     

海洋天然活性小分子物质抗乙肝病毒效果筛选

目的　通过对从海洋生物提取的天然小分子物质进行体外抗乙肝病毒效果评价,希望能筛选出一些具有抗乙肝病毒(HBV)活性的物质。方法　采用HepG2.2.15细胞系作为抗HBV的筛选工具,用不同浓度的海洋小分子物质对其进行干预,测定小分子物质能否对细胞系分泌HBV产生影响。结果　本研究共评价了20种海洋天然小分子化合物,在对HBsAg、HBeAg和HBVDNA分泌的抑制作用方面,环（甘氨酸-L-脯氨酸）(H5）、环（4-羟基脯氨酸-苯丙氨酸）(H10）、环（L-2-羟基脯氨酸-苯丙氨酸）(H12)的治疗指数均大于2,其余17种化合物治疗指数均小于1。结论　海洋天然活性小分子物质环（甘氨酸-L-脯氨酸）、环（4-羟基脯氨酸-苯丙氨酸）、环（L-2-羟基脯氨酸-苯丙氨酸）三种化合物具有抗HBV活性,随着药物浓度的增加,它们对HBsAg、HBeAg及HBV DNA抑制作用也增加,呈明显剂量反应关系。     

Inhibition of Intestinal Tumorigenesis in Apc Min/+ Mice by Green Tea Polyphenols (Polyphenon E) and Individual Catechins

In this work, we compared the cancer preventive activities of Polyphenon E (PPE), a standardized green tea polyphenol preparation given in diet versus drinking fluid as well as the activities of PPE versus individual catechins. We treated Apc^Min/+ mice for 9 wk with 0.08% (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), 0.08% (-)-epicatechin-3-gallate, or 0.12% PPE in drinking fluid or diet. Only 0.12% dietary PPE and 0.08% EGCG in drinking fluid significantly decreased tumor multiplicity (70% and 51%, respectively). Compared to PPE in drinking fluid, dietary PPE delivered twofold more EGCG to the small intestine. Immunohistochemistry showed that adenomas in groups treated with PPE and EGCG had decreased cell proliferation, β -catenin nuclear expression, and phospho-Akt levels; higher cleaved caspase-3 levels, and partially restored retinoid X receptor α expression. The results suggest that these molecular events contribute to the cancer prevention activity of EGCG and PPE. Furthermore, diet appears to be a better route of administration for PPE than drinking fluid.     

Epigallocatechin gallate changes mRNA expression level of genes involved in cholesterol metabolism in hepatocytes

Catechins, compounds derived from green tea, have been shown to improve cholesterol metabolism in animal studies, but the molecular mechanisms underlying this function have not been fully understood. We performed DNA microarray analysis in order to clarify the effects of epigallocatechin gallate (EGCG), the dominant catechin in green tea, on cholesterol metabolism in HepG2 hepatocytes. This revealed that the expression levels of several genes related to cholesterol metabolism, including the LDL receptor, were changed by EGCG treatment. Using a real-time PCR technique, we confirmed that EGCG treatment up-regulated mRNA expression level of the LDL receptor. Moreover, EGCG decreased extracellular apoB levels. These findings indicated that EGCG improves cholesterol metabolism through the up-regulation of LDL receptor and also reduces extracellular apoB levels.     

EGCG和红茶多酚对HepG_2细胞脂质代谢相关基因表达的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和红茶多酚对人肝细胞癌HepG2细胞脂质代谢相关基因表达的影响。方法:HepG2细胞经EGCG(5μmol/L),红茶多酚(5μg/ml)或0.1%二甲亚枫(对照组)处理8h后,抽提RNA,并杂交至人14kcDNA芯片进行基因表达谱分析。应用实时RT-PCR技术对芯片结果进行验证。结果:HepG2细胞经EGCG和红茶多酚处理后表达差异的脂质代谢相关基因数分别为13条和29条,其中表达差异一致的基因有6条。实时RT-PCR结果与芯片结果一致。结论:EGCG和红茶多酚影响脂质代谢的机制是复杂的,此次实验发现的新靶标为今后茶多酚降脂作用研究提供了新的依据。     

化学合成多肽体外抗HBV复制的研究

目的 观察人工设计并化学合成的多肽在体外乙型肝炎病毒（HBV）复制模型中对HBV-DNA复制、病毒标志物表达的影响，及其细胞毒性强弱，筛选高HBV抑制且低细胞毒性的多肽，探索多肽作为新型HBV抗病毒药物分子的潜力。方法 采用传统的甲基丙烯酸聚合物平台设计并合成的7种多肽（KBDT-1、2、3……7，以疏水性及阳离子电亲和力大小为依据），将7种化学合成多肽（10 mg/mL）、拉米夫定（1 mg/mL，阳性对照）、空白溶剂（阴性对照）作用于HepG 2.2.15细胞系，检测化学合成多肽对HBV的抑制作用，采用结晶紫染色法检测细胞存活率，比较各组药物对细胞毒性的强弱。选取HBV抑制作用最强的多肽，设置10、1、0.1 mg/mL浓度梯度，分别处理HepG 2.2.15细胞3、6、9 d后，收集细胞上清液，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测病毒DNA拷贝量，化学发光微粒子免疫分析法检测HBsAg及HBeAg的变化。结果 从7种化学合成多肽中筛选出多肽KBDT-2，RT-PCR结果显示，KBDT-2具有体外抗HBV复制作用，且药物浓度越高，抑制效果越好；化学发光微粒子免疫分析法检测显示，KBDT-2对HBV生物学标志物HBsAg及HBeAg有抑制作用；结晶紫染色检测结果显示，KBDT-2对HepG 2.2.15无明显毒性作用。结论 KBDT-2具有抑制HBV复制作用，且无明显细胞毒性，可以有效降低HBsAg、HBeAg表达，为探索抗HBV新型药物提供了实验数据支持。     

The behaviour of green tea catechins in a full-fat milk system under conditions mimicking the cheesemaking process

Due to their well-known health benefits, green tea catechins have received recent attention as natural additives in foods such as dairy products. However, they may present some irreversible associations with milk components (e.g. protein and milk fat globules). To investigate the behaviour of two important green tea catechins, (+)-catechin (C) and (?)-epigallocatechin gallate (EGCG), in a standard whole milk system under the conditions of cheesemaking, 250 and 500?ppm of each catechin were added to whole milk (3.3% fat). Although both C and EGCG at either concentration increased both total phenolic content and total antioxidant capacity of the subnatants obtained from the milk system, there was a less linear increase when the concentration of the catechins was doubled, whereas C or EGCG were recovered (measured by HPLC) differently. Overall, these results suggest a degree of associations between green tea catechins with milk proteins and milk fat.