表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27 000外膜蛋白的重组卡介苗构建

目的：构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27000外膜蛋白的重组卡介苗。方法：用PCR技术从卡介苗基因组扩增分枝杆菌19000抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27000外膜蛋白基因，将它们分别插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbαⅠ／BamHⅠ和BarnHⅠ／HindⅢ位点。将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌并从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗。结果：从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性的重组卡介苗菌落，用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗，发现一约27000的蛋白带与贝氏柯克斯体27000重组蛋白免疫兔血清发生特异性反应；27000重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗，结果为阳性。结论：重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27000外膜蛋白，表达的27000外膜蛋白存在于卡介苗菌体表面，卡介苗菌体表面的27000抗原可能诱导抗Q热免疫应答。     

重组外膜脂蛋白LipL32与致病性钩端螺旋体抗体的免疫反应性及与不同血清群交叉反应性的Western blotting评价

目的研究钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32与致病性钩体抗体的免疫反应性以及与不同钩体血清群之间的交叉反应性,为钩体病的血清学检测提供抗原。方法依据黄疸出血群赖型56601株外膜脂蛋白LipL32基因序列设计引物,扩增出该基因片段DNA,将其克隆至表达载体pET-28a中。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21并诱导表达,表达的重组蛋白纯化后采用Western blotting评价其与56601株及其他14个血清群致病性钩端螺旋体抗体的免疫反应性和交叉反应能力。结果扩增获得了56601株脂蛋白LipL32基因,成功构建了原核表达重组质粒pET28a-LipL32。重组蛋白rLipL32为包涵体表达,且与56601株及另外14个血清群的致病性钩端螺旋体的兔抗体发生了特异性免疫反应。结论原核表达重组外膜脂蛋白rLipL32在致病性钩体血清群之间有良好的交叉反应能力,可初步作为属范围内的钩端螺旋体抗体检测候选抗原。     

犬型钩端螺旋体抗血清被动免疫保护力初步测试

目的：拟通过大型钩端螺旋体56603株39KD抗原抗血清的制备及其抗血清免疫保护力测试，为钩体病的诊断与防治研究提供资料。方法：将39KD抗原采用四种方法接种家兔制备抗血清，然后通过被动免疫途径，对其抗血清免疫保护力进行测试。结果：四种方法接种家兔制备的抗血清凝集效价均在200左右，四者无显著差异。除1株非致病钩体Patoc Ⅰ外，其抗血清能保护豚鼠免受10株致病性钩体(10群10型)的攻击。结论：犬型钩体39KD抗原抗血清，具有很好的动物免疫保护作用，具有种特异性，值得进行深入的研究。     

贝氏柯克斯体34×103重组外膜蛋白的免疫保护性

目的原核细胞表达贝氏柯克斯体34×103外膜蛋白基因,评价34×103重组外膜蛋白的免疫保护性.方法用PCR从我国贝氏柯克斯体分离株的基因组中扩增34×103外膜蛋白基因,用该基因与原核表达质粒重组,构建重组表达质粒;用IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白.用重组蛋白皮下接种免疫BALB/c小鼠2次,在加强免疫后的第28天,用ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平以及作体外脾淋巴细胞增殖试验检查小鼠的特异性细胞免疫水平;用10 ID50贝氏柯克斯体腹腔注射攻击免疫小鼠,攻击后第7天病理学检查小鼠脏器的组织病变和染色镜检脾脏的贝氏柯克斯体.结果SDS-PAGE和免疫印迹分析证明重组质粒转化的大肠杆菌产生了34×103重组蛋白,重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清发生特异性反应.ELISA法检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组蛋白抗体,免疫小鼠的体外淋巴细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.组织病理学检查发现免疫小鼠的肺、肝、脾无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏肿大并含有大量的柯克斯体.结论重组34×103外膜蛋白具有的免疫保护性,能够诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答.     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

人白细胞介素17的多克隆抗体制备与单抗杂瘤的筛选

目的：制备重组人IL－17的兔抗血清并纯化,克隆化筛选IL－17的阳性杂交瘤克隆。方法：应用纯化的IL－17程序免疫家兔,得到兔抗人IL－17的抗血清;采用盐析法和亲和层析法对兔抗血清进行纯化,应用纯化的IL－17免疫小鼠,将其脾脏与骨髓瘤细胞SP2／0融合,采用有限衡释法和克隆化筛选阳性杂交瘤克隆,抗体的检测分别用脂糖双向扩散试验法和酶联免疫测定法（ELISA）。结果和结论：纯化得到多克隆抗体2．5ml,IgG纯度大于95％,初步得到5个阳性杂交瘤克隆,可用于以后的深入研究。     

TRAP蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)毒素的调控机制，构建pET—trap表达载体，在大肠杆菌中表达金葡菌毒素调控的重要分子TRAP蛋白。方法：从金葡菌中提取基因组DNA，用特异引物钓取trap基因。通过亚克隆的方法构建了pET—trap表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，经亲和柱层析分离纯化。制备纯化蛋白的多抗血清，利用Western印迹检测多抗与天然蛋白的反应。结果：目的基因在大肠杆菌中获得高表达，超声破碎后，表达产物主要存在于上清中，制备的多抗血清可以与天然蛋白发生特异性反应。结论：通过原核表达获得了天然的TRAP蛋白，为研究金葡菌毒素调控机制及防治金葡菌感染奠定了基础。     

功能未知基因LOC410296的表达载体构建及小鼠抗血清制备

目的：为深入研究功能未知基因LOC401296,首先获取其全长序列,实现LOC401296分子的真核和原核表达,并制备针对 LOC401296蛋白的抗血清。方法采用 PCR 方法克隆 LOC401296编码区全长序列,利用pET28B和pCMV-Myc质粒构建LOC401296原核表达和真核表达载体,用异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白原核表达,目的蛋白经纯化、复性后免疫小鼠制备抗血清。结果 PCR克隆得到LOC401296编码区全长序列,成功构建LOC401296原核及真核表达载体,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌体内表达,用纯化蛋白免疫小鼠获得抗人LOC401296蛋白血清, ELISA检测抗血清效价达1∶64000,Western印迹证实LOC401296真核表达载体成功表达且抗血清特异性良好。结论获得LOC401296基因编码区全长序列,成功构建了LOC401296基因表达载体,分别在大肠杆菌和真核细胞内实现LOC401296蛋白原核表达和真核表达,获得小鼠抗人LOC401296蛋白抗血清,为LOC401296基因功能研究奠定了基础。     

福氏2a痢疾菌多糖蛋白结合抗原的制备和免疫原性观察

提取福氏２ａ痢疾菌脂多糖中的多糖抗原与白喉类毒素共价交联，能增强多糖抗原对家兔的免疫原性，抗多糖抗体与抗载体蛋白抗体的反应规律基本一致，有二次免疫应答。抗血清能与福氏各型痢疾菌的脂多糖反应，与其它各群痢疾菌无交叉反应，其针对的主要抗原决定簇为福氏多糖骨架。     

沙门菌属pad蛋白的原核表达及抗原性的鉴定

目的在大肠杆菌中表达沙门菌属pad蛋白,纯化后制备兔抗pad抗体。方法利用PCR方法从肠炎沙门茵中扩增出pad基因,构建pET一32a（＋）一pad重组表达质粒;将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性克隆,测序鉴定后,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间以诱导重组蛋白的表达;以纯化的pad蛋白免疫家兔,制备抗pad多克隆抗体并进行鉴定。结果与结论成功扩增得到pad基因,经双酶切和测序证实重组表达质粒构建成功,经过诱导条件的优化,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为41×10。的目的蛋白;纯化的重组蛋白免疫家兔后,能够有效地刺激家兔产生特异性抗体,经琼脂糖双向扩散测定抗血清效价达到1：32以上。为进一步研制沙门茵属体外快速检测试剂打下了基础。     

小鼠Mu/Hb感染模型的建立

采用细菌混合胃膜素(mucin,Mu)、血红蛋白(Hemoglubin,Hb)感染小鼠,建立小鼠Mu/Hb感染模型,并在此模型中评价了内毒素核心精脂单克隆抗体(3H_42F_7、2D_6E_7)抗S.minnesota野生菌的保护效果。Mu和Hb本身对小鼠无致病作用,然而与攻击菌混合感染小鼠,能显著增强攻击菌毒力,降低攻击菌的半数致死剂量(LD_(50),在本次实验中使S.minnesoat野生茵LD_(50)降低了2000倍。在该模型中,3H_42F_7抗体表现良好抗S.minnesota野生菌感染的作用,且呈剂量依赖性;2D_6E_7抗体未显示有明显保护性(P>0.01),提示Mu/Hb感染模型适用于评价内毒素核心糖脂抗体抗革兰氏阴性菌感染作用。     

A rapid method for the determination of human CEA/mouse anti-CEA immune complexes in patients undergoing immunoscintigraphy

We report here on a new and quick procedure to isolate human (hu) CEA mouse anti CEA immune complexes of sera from patients admitted for immunoscintigraphy with radiolabeled monoclonal anti CEA antibody. This method employs rabbit anti mouse IgG immune affinity chromatography together with a commercial CEA-IRMA kit for the specific isolation of immune complexes. By applying this procedure we were able to show that immune complex formation increased in parallel to CEA serum concentration. The formation of immune complexes did not significantly affect tumor detection by immunoscintigraphy.Abbreviations CEA Carcinoembryonic antigen - DTE Dithioerythritol - EDTE Ethylenediaminetetraacetate - PMSF phenylmethylsulfonyl flouride - IRMA immunoradiometric assay - p.i. post injectionem Deceased     

苯扎溴铵对ICU内泛耐药鲍曼不动杆菌杀灭效果的研究

目的研究苯扎溴铵对ICU内分离的泛耐药鲍曼不动杆菌(PDR-Ab)的杀菌效果及抗性。方法采用最低抑菌浓度(MIC)、悬液定量杀菌试验,观察苯扎溴铵对ICU内分离的PDR-Ab的杀菌效果,并与大肠埃希菌标准菌株进行对比;采用PCR法检测PDR-Ab中qacE△1-sulI的携带情况。结果苯扎溴铵对65株PDR-Ab的MIC值是9~36 mg/L,大部分高于标准菌株;500 mg/L苯扎溴铵作用5 min以上对PDR-Ab的杀灭对数值>5.00;65株PDR-Ab中51株携带qacE△1-sulI基因,检出率78.46%。结论 ICU内PDR-Ab携带qacE△1-sulI基因携带率高,提示ICU内的PDR-Ab对苯扎溴铵存在抗性。     

A rapid method for the determination of human CEA/mouse anti-CEA immune complexes in patients undergoing immunoscintigraphy

We report here on a new and quick procedure to isolate human (hu) CEA mouse anti CEA immune complexes of sera from patients admitted for immunoscintigraphy with radiolabeled monoclonal anti CEA antibody. This method employs rabbit anti mouse IgG immune affinity chromatography together with a commercial CEA-IRMA kit for the specific isolation of immune complexes. By applying this procedure we were able to show that immune complex formation increased in parallel to CEA serum concentration. The formation of immune complexes did not significantly affect tumor detection by immunoscintigraphy.     

预防HIV阳性烧伤患者职业暴露的体会

目的 总结预防HIV阳性烧伤患者职业暴露的防护措施.方法 采取严格隔离防护、尽快封闭创面、减少暴露部位、规范化操作、防止交叉感染和职业暴露、切断传播途径为主的综合性预防措施.结果 经过严格的管理和防护,无一例职业暴露发生.结论 时刻注意自我保护,将暴露减少到最低、规范化操作是减少交叉感染、防止职业暴露的保证.     

Radiographic contrast media induced nephropathy: experimental observations and the protective effect of calcium channel blockers.

Combined acute inhibition of the synthesis of nitric oxide with L-nitroarginine methyl ester (L-NAME) and of prostacycline synthesis with indomethacin predisposes rats to severe renal injury from radiographic contrast media. The reliability of this pharmacological manipulation in the study of radiographic contrast medium induced nephropathy (RCMN) was investigated. Adult male Sprague-Dawley rats were injected with iv L-NAME (10 mg kg(-1)) and iv indomethacin (10 mg kg(-1)) 15 min apart and prior to injection of RCM or normal saline (control group). A dose-dependent reduction in renal function was observed after intravascular injection of the high osmolar RCM diatrizoate (Angiografin, 306 mgI ml(-1)). A significant (p<0.01) increase in serum creatinine (Cr) (from 54.66+/-8.39 micromol l(-1) to 171.96+/-24.49 micromol l(-1) and from 80.95+/-6.73 micromol l(-1) to 204.76+/-16.73 micromol (-1), n=5 per group) was observed 24 h after injection of 6 ml and 8 ml of diatrizoate, respectively. The increase in serum Cr after injection of 8 ml of diatrizoate recovered spontaneously to 80.87+/-8.70 micromol l(-1) 7 days after injection. No significant change in renal function was observed in the control group (n=5) receiving 8 ml kg(-1) of normal saline or after injection of 4 ml of diatrizoate (serum Cr 69.84+/-5.5 micromol l(-1) pre contrast injection and 66.67+/-13.47 micromol l(-1) 24 h post contrast injection, n=5). The increase in serum Cr observed with 6 ml of diatrizoate was significantly higher (p<0.01) than the rise induced by equivolume of the low osmolar non-ionic monomer iopromide (Ultravist, 300 mgI ml(-1)) (serum CR 68.47+/-8.39 micromol l(-1) pre contrast injection and 143.59+/-32.03 micromol l(-1) 24 h post contrast injection, n=5). The calcium channel blocker diltiazem (10 mg kg(-1) injected intraperitoneally 30 min prior to RCM injection) prevented the rise in serum Cr observed with 6 ml of diatrizoate (serum Cr pre contrast injection 70.31+/-7.28 micromol(-1) and 78.21+/-17.81 micromol(-1) 24 h post contrast injection in animals pre-treated with diltiazem, n=5). The protective effect against RCM-induced reduction in renal function was less with lower doses of diltiazem. In conclusion, the animal model used is reliable and reproduced previously established observations in the field of RCMN. The protective effect of a calcium channel blocker at the appropriate dose against RCMN has also been shown. The clinical effectiveness of this class of drugs in preventing RCMN requires further evaluation.     

卡介菌多糖核酸注射液对部队肺结核患者免疫球蛋白和C3、C4的影响

 目的 观察卡介菌多糖核酸注射液对部队肺结核患者抗结核治疗前后免疫球蛋白IgA、IgG、IgM和补体C3、C4的影响,评价该药治疗肺结核的免疫调节作用.方法 肺结核患者随机分为治疗组和免疫治疗组.两组都使用短程标准抗结核方案2HRZF/4HR,免疫治疗组联合使用卡介菌多糖核酸注射液,治疗前和治疗开始后第1、2个月检查IgA、IgG、IgM和C3、C4,并与20例健康人血清作对照组.结果　和健康对照组比较,两组肺结核患者治疗前IgG、IgM和C3有不同程度下降(P＜0.05),而C4下降不明显(P＞0.05),治疗前两组肺结核患者上述指标间差异无显著性(P＞0.05);免疫治疗组采用卡介菌多糖核酸注射液后IgM、IgG和C3、C4明显增高,显著高于治疗组(P＜0.05),而IgA变化不明显(P＞0.05).卡介菌多糖核酸治疗组患者疗效好于对照组(P＜0.05).结论 卡介菌多糖核酸注射液具有调节肺结核患者机体免疫功能作用,可辅助提高抗结核药物对肺结核疗效.     

抗HBsAg单克隆抗体杂交瘤的建立与临床应用

目的 制备分泌抗HBsAg单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立快速诊断HBsAg的方法奠定了基础。方法 通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株,利用ELISA测定单抗的特异性,并用此单抗对临床标本进行初步检测。结果 细胞株分泌的单抗可与HBsAg特异性结合,与乙肝病毒E抗原和核心抗原无交叉反应,经免疫扩散试验分析为IgG1型,将此单抗用辣根过氧化物标记后可与HBsAg阳性的病人血清反应。结论 筛选出了一株适合临床应用的单抗杂交瘤细胞株。     

构建现代系统免疫学新的实验研究体系

1981年Siegel等提出红细胞免疫系统的新概念，1982年郭峰首先发现红细胞能黏附补体包被的酵母菌。郭峰于1986年发现红细胞可黏附补体包被的癌细胞，并于1999年发现1滴血细胞悬液（包括红细胞、白细胞）能黏附补体包被的癌细胞，在各种血细胞黏附癌细胞形成的花环（黏附率）中，红细胞黏附率占99％，而白细胞黏附率只占1％。2001年郭峰发现红细胞促进淋巴细胞CR1天然免疫活性（或T淋巴细胞或NK细胞活性）与红细胞CR1基因密度多态性表达密切相关。2004年郭峰提出“红细胞天然免疫主干道理论”，认为存在血液免疫反应路线图：抗原（如癌细胞或酵母菌等）进入血循环可首先激活血浆中的补体，黏附上C3b等补体成分，然后黏附上红细胞，经处理后，最终黏附上白细胞，激活一系列血液免疫反应。郭峰认为在抗致病原的过程中存在4个要素：抗原、血浆（补体）、红细胞、白细胞。红细胞和补体在血液免疫反应调控中扮演重要的角色。我们构建了“现代免疫学新的实验研究体系”。癌细胞（或酵母菌）是一种抗原性细胞，能激活血液免疫反应，可以建立一种“血液免疫反应路线图”新的实验体系。各种免疫指标的变化（包括黏附率、IL-8、IL-12、CD35、CD44、CD55、CD59、CD4、C138、CD2、CD25、CXCR4、Fy6等）显示癌细胞（如S180）能激活血液免疫反应。因此，在此新的实验系统中，我们可以用许多新的有效的免疫学方法，研究血细胞和血浆之问、红细胞与白细胞之间的内在联系，并为天然免疫和适应性免疫研究及临床免疫治疗提供一种有用的方法。