成体小鼠脊髓实质神经干细胞的分离培养及其多能性的鉴定

目的从成年小鼠脊髓实质中分离培养并鉴定成体神经干细胞。方法采用无血清培养基及单细胞克隆技术，从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得大量具备单细胞克隆能力的细胞，经免疫荧光染色证实单克隆细胞表达Nestin抗原并在分化后表达各种特异性的神经细胞抗原。结果从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得的具备连续克隆能力的细胞可表达神经干细胞的Nestin抗原，并且分化后表达神经元及胶质细胞的特异性抗原。结论成功地从成年小鼠的脊髓实质中分离出具备增殖分化能力的成体神经干细胞，为进一步利用其进行脊髓损伤治疗的研究提供了实验基础。     

嗅鞘细胞对脊髓源性神经干细胞分化的影响

目的 探讨嗅鞘细胞对脊髓源性神经干细胞分化的作用。方法 应用Millicell插入式细胞培养皿，大鼠脊髓源性神经干细胞与嗅鞘细胞在无血清培养液中共培养，通过免疫化学染色方法，检测脊髓源性神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例。结果 共培养7d后，脊髓源性神经干细胞分化为神经元的比例高达43．5％，明显高于对照组的21．4％。结论 嗅鞘细胞提供的微环境可促进脊髓源性神经干细胞分化为神经元。     

胚胎干细胞在脊髓损伤中的应用

神经干细胞具有自我增殖、分化、迁移及建立突触联系的特征,并可促进损伤神经组织的修复与再生。最近发现,经胚胎干细胞诱导的神经前体细胞植入受损伤的脊髓中,可分化为神经元和神经胶质细胞,并能促进脊髓功能的恢复,提示胚胎干细胞在中枢神经系统的治疗中具有广阔的应用前景。     

脊髓损伤新型神经细胞支架材料研究进展

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是临床上有严重危害的急性病损。目前脊髓损伤修复研究的主要方向是利用组织工程和神经干细胞修复损伤脊髓。方法是将一定量的细胞种植到具有一定结构的三维支架上，然后将此细胞-支架复合物植入体内或体外继续培养，通过细胞间的相互粘附，增殖和分化，分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官，达到修复损伤脊髓的目的。     

聚乙醇酸支架组织工程神经复合物修复大鼠脊髓损伤

目的 利用组织工程技术体外初步构建组织工程神经复合物，对成年大鼠损伤脊髓进行修复并观察其效果。方法 （1）分离培养大鼠神经干细胞（neural stem cells, NSCs），体外构建NSCs／聚乙醇酸（PGA）支架复合物，以胚胎脊髓提取液对NSCs进行诱导分化，通过组织化学检测和扫描电镜观察该复合物结构。（2）制作大鼠脊髓半横断损伤模型，植入组织工程神经复合物，术后6周通过功能学和组织学检查评估修复脊髓损伤的效果。结果 （1）体外构建的NSCs／PGA支架组织工程神经复合物含有神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等成分，有独特的组织结构。（2）组织工程神经复合物移植后，其内的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞可以存活并继续成熟，成年大鼠损伤脊髓平面以下运动功能获得了较明显的恢复。结论 体外构建的组织工程神经复合物对成年大鼠损伤脊髓的结构重建和功能恢复都有一定的作用。     

移植神经干细胞促进脊髓全横断大鼠结构与功能修复的研究

目的　探讨移植神经干细胞对脊髓全横断性大鼠部分结构与功能修复的影响。方法　在脊髓全横断处移植神经干细胞 6 0d后 ,在横断处下方 3mm注射荧光金逆行标记轴突再生的上运动神经元 ,用免疫组织化学检测神经干细胞在宿主内的分化 ,同时用体视学方法观测脑干细核和大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层的神经元密度变化。用BBB评分法和爬网格法观测大鼠后肢运动功能的恢复等。结果　移植的神经干细胞能在宿主内存活并向前后方向迁移到脊髓内 ,部分神经干细胞分化为GFAP、NF - 2 0 0和GAP -43阳性细胞。移植神经干细胞后在红核和感觉运动区内锥体细胞层可见有被荧光金荧光金标记的神经元胞体 ,脊髓横断处附近脊髓组织的溃变程度减轻 ,红核及躯体感觉运动区内神经元密度高于未移植组 ,大鼠后肢的自主运动功能明显好于未移植组。结论　神经干细胞移植入损伤脊髓后能分化为神经元及神经胶质细胞 ,能减轻脊髓的继发性损伤 ,保护受损伤的神经元 ,促进运动功能的恢复     

恒河猴骨髓基质细胞体外诱导分化成神经干细胞的实验研究

为研究恒河猴骨髓基质细胞（BMSC）体外培养及诱导分化为神经干细胞的可行性，分离恒河猴BMSC，在体外应用神经干细胞培养液和细胞因子进行诱导分化，利用免疫细胞化学方法进行鉴定。结果发现，恒河猴BMSC能在体外培养中增殖，分化和表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白（Nestin)，并最终能分化为胶质细胞样细胞和神经元样细胞；免疫细胞化学检测可见有神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）抗原表达；未发现维甲酸（RA），表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)对骨髓基质干细胞的诱导分化具有明显影响作用。提示恒河猴BMSC是具有较强的自我更新能力和多分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为表达神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）抗原的细胞，可作为神经细胞的种子细胞。     

静脉移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤

目的 研究静脉移植骨髓间充质干细胞(bone martow stromal cells,BMSCs)对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响.方法 对10只同种异体SD大鼠的BMSCs进行体外分离、培养、扩增、纯化后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)进行标记;重物打击致瘫痪造模法制成完全性截瘫的同种大鼠脊髓损伤动物模型,制模后7 d完全随机分为A、B、C三组:A组22只,作为BMSCs移植组,经鼠尾静脉注射2×106/ml的BMSCs细胞悬液1 ml;B组22只,作为对照组,注射1 ml培养液;C组22只,作为空白手术对照组.注射后2,3,6周,免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化并计数,观察损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)和巢蛋白的表达,注射后1,2,3,4,5,6周Basso-Beattie-Bresnaban(BBB)评分评估各组后肢运动功能.结果 移植后2,3,6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内.计数发现,移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,3周占4.4%,6周占2.9%;移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达胶质纤维酸性蛋白(glial fribrillary acidic protein,GAFP),约5.4%表达神经元特异性核蛋白(neuronal nuclear antigen,NeuN);移植后2,3,6周,A组GAP-43、NF200、巢蛋白的表达明显高于B、C组(P<0.05);移植后3周开始,A组的BBB评分在各观察时相点明显高于B、C组(P<0.05).结论 通过静脉注射的BMSCs能向脊髓损伤灶内迁徙、存活,表现出对损伤灶的趋化性,并向神经元和星形胶质细胞分化,上调GAP-43、NF200和巢蛋白的表达,改善神经功能,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗.     

神经干细胞移植促进大鼠损伤脊髓的修复

笔者建立神经千细胞体外培养体系，经BrdU标记后植入大鼠纽约大学(NYL)脊髓损伤模型，通过BBB运动功能评分法：评价人鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显做镜观察移植神经干细胞的存活、迂移及损伤部位脊髓的修复情况，探讨神经干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性     

真皮多能干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

目的：观察真皮多能干细胞（dMSCs）移植对脊髓损伤大鼠运动功能的修复作用。方法：32只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型，并随机分为真皮多能干细胞移植组（A组）及损伤对照组（B组），每组10只大鼠。伤后1w，移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞（dMSCs），而对照组仅注射等量PBS。分别于移植后1d、1w、8w、12w对两组大鼠进行动物行为学（BBB）评分和脊髓诱发电位（SEP和MEP）检测，并于移植后12w进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测。结果：BBB评分4w以后组间比较差异有统计学意义（P〈0．05），移植组明显高于对照组（P〈0．05）；SEP和MEP潜伏期和波幅值在8、12w后组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）；移植后12w，移植组损伤脊髓结构的修复明显优于对照组。结论：移植治疗脊髓损伤，能明显改善其运动功能和神经形态，dMSC对脊髓损伤大鼠有治疗作用。     

慢性压迫性脊髓损伤后神经前体细胞的增殖情况

目的　通过分析成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后及减压后巢蛋白表达的变化 ,探讨神经前体细胞的增殖。　方法　选用健康Wistar大鼠 5 0只 ,体重 2 80～ 32 0g。制备慢性压迫性脊髓中度、重度损伤及重度压迫损伤减压后 3,10d模型 ,自距压迫边缘至 5mm段脊髓组织切片。正常成年健康大鼠作为正常对照组。巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白采用免疫组织化学染色 ,计算机图像分析仪定量分析 ,观察神经前体细胞的增殖情况。　结果　成年大鼠慢性压迫性脊髓中、重度损伤及重度压迫损伤减压后 3d ,巢蛋白在白质、灰质及脊髓中央管的室管膜细胞和减压后 10d组白质中均有明显表达 (P <0 .0 5 ) ,以重度压迫组最为显著 (P <0 .0 1)。减压后 10d组灰质与正常对照组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。与正常对照组相比 ,各损伤组脊髓内胶质纤维酸性蛋白表达增强 ;胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数目增多 ,胞体肥大 ,突起增粗、增长。　结论　成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤及减压后早期存在神经前体细胞增殖。星形胶质细胞参与神经前体细胞的增殖与迁移 ,对脊髓具有重要的营养修复作用。     

大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的　探讨大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。　方法　将60只大鼠分为脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙组(A组,30只)和单纯脊髓损伤组(B组,30只)。损伤后1,3,7,14,28　d,对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测（原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记法,TUNEL）以及Bcl-2蛋白表达的测定（免疫组化SP法）。　结果　A、B两组中均发现凋亡细胞及Bcl-2蛋白阳性表达。大鼠脊髓损伤后3d图像分析表明,细胞凋亡率分别为A组（12.43±5.16）,B组（36.27±6.28）;Bcl-2蛋白阳性细胞分别为A组（37.68±5.83）,B组（21.48±7.83）。两组比较,差异有显著性意义(P<0.01和0.05)。　结论　脊髓损伤可导致神经细胞凋亡,大剂量甲基强的松龙能抑制细胞凋亡。     

不同压力高压氧治疗对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的 观察不同压力的高压氧(HBO)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞凋亡的影响,探讨HBO治疗SCI的最佳压力.方法 90只SD大鼠采用Allen's打击法造成SCI后随机分为5组:对照组(A组)、0.15 MPa HBO组(B组)、0.20 MPa HBO组(C组)、0.22 MPa HBO组(D组)和0.25 MPa HBO组(E组).损伤后第3、7、14天分别对5组大鼠进行取材,采用Tunel法检测凋亡细胞,光镜下观察,并对结果进行统计学分析;神经功能评价采用开放场地实验评估大鼠后腿运动功能(BBB评分).结果 与A组比较,HBO各压力组在3个时间点凋亡的细胞数有所减少,神经功能有所改善,且差异有统计学意义(P＜0.05).与B组比较,C、D和E组凋亡的细胞数有所减少,BBB评分改善,且差异有统计学意义(P＜0.05).与C组比较,E组于第3和第7天的差异有统计学意义(P＜0.05);第14天的差异无统计学意义(P＞O.05).结论 HBO能抑制SCI后细胞的凋亡,其作用在一定范围内与压力的升高相关.

Abstract：

Objective To study the effects of HBO at different pressures on apoptosis following spinal cord injury in rats and also to investigate ideal pressure value of hyperbaric oxygen(HBO) on spinal cord injury (SCI). Methods The SCI model was established with Allen's weight dropping by using 90 SD rats. Then, the animals were randomly divided into 5 groups following SCI: the control group ( group A); the HBO treatment group at 0. 15 Mpa (group B); the HBO treatment group at 0. 20MPa (group C); the HBO treatment group at 0. 22 Mpa ( group D); the HBO treatment group at 0.25 Mpa ( group E). Segments of injured spinal cord were collected from the animals of the 5 groups for studies on the 3rd, 7th, and 14th days after injury. The apoptosis cells were labeled with Tunel and the neurologic function of the spinal cord was assessed in the open field ( the BBB score ). Results The number of Tunel - positive cells decreased considerably and the BBB score improved significantly in all the animals of the HBO groups when compared with those of group A ( P ＜ 0. 05 ). Same results were found when the group C, group D and group E were compared with group B, with statistical significance( P ＜0. 05). The number of Tunel-positive cells were decreased considerably and the BBB score improved significantly on 3rd and 7th days in group E, when compared with those of group C( P ＜ 0. 05 ), with statistical significance( P ＜ 0. 05 ). However, no statistical significance could be noted on the 14th day (P ＜0.05). Conclusions HBO could inhibit apoptosis in rats following spinal cord injury, which might be correlated with the increase of pressure within a certain range.     

经骨髓间充质干细胞诱导分化的神经样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用

 目的 探讨经骨髓间充质干细胞诱导分化的神经样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法 提取、培养和扩增骨髓间充质干细胞后,在体外诱导分化为神经样细胞。大鼠脊髓损伤造模后,分别进行神经样细胞、骨髓间充质干细胞及无细胞悬液移植,每组18只。术后采用BBB评分及斜板实验观察3组大鼠的运动功能恢复情况。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞后,经免疫组化染色发现具备神经细胞特征。术后6周,BBB评分方面,实验组(16.56±2.42)优于阳性对照组(13.70±2.66),后者又优于阴性对照组(8.37±2.35)。Rivlin斜板实验评分方面,实验组术后2、4、6周,均优于阳性对照组,后者又均优于阴性对照组。实验组术后可见较多的神经纤维,结构完整,优于阳性对照组及阴性对照组。结论 体外诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化后,移植治疗大鼠脊髓损伤具有良好效果。
     

神经干细胞移植联合神经节苷脂治疗大鼠脊髓损伤

目的 观察神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialotetrahexosyl ganglioside,GM1)治疗大鼠急性脊髓损伤的作用。 方法 采用成年SD大鼠,制作T8节段脊髓压迫损伤模型。动物按随机数字表法分为三组：对照组、NSCs组、NSCs+GM1组。连续观察1,2,4,8周,应用运动功能评分、病理组织学、透射电镜、体感诱发电位(SEP)等检查,比较大鼠脊髓神经功能的恢复情况。 结果 伤后动物后肢运动功能均有不同程度恢复,4,8周时NSCs+ GM1组显著高于其他组(P＜0.01),降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)染色阳性细胞较其他各组增多。与对照组和NSCs组比较,8周时NSCs+ GM1组只在损伤中心处出现灶性坏死,小血管增生明显。电镜扫描结果显示,8周时对照组仍可见大的神经髓鞘轴膜下水肿,而NSCs+ GM1组可见大量完整的神经髓鞘和分化正常的神经细胞,轴突末端还可见多种突触小泡。SEP结果显示,移植后2周NSCs+ GM1组SEP的潜伏期即明显缩短(P＜0.05),4,8周SEP缩短以NSCs组为显著,但仍高于实验正常鼠潜伏期。 结论 脊髓损伤大鼠移植NSCs联合应用GM1能够保护受伤的神经组织。GM1可促进植入的NSCs分化,并与宿主形成突触连接,重建脊髓功能。     

大鼠脊髓打击伤模型的建立及病理观察

目的 观察改良大鼠脊髓打击伤模型的病理变化,评价该模型的稳定性、重复性和一致性. 方法 应用改良重物坠落打击装置建立大鼠脊髓中、重度损伤模型,通过BBB评分、神经电生理监测、免疫组化及光电镜技术观察脊髓损伤(SCI)后两组大鼠功能及病理变化特点,以评价本实验模型的重复性及与损伤程度相关的一致性. 结果 脊髓损伤后两组大鼠的后肢运动功能均有不同程度恢复,运动和感觉诱发电位提示神经信号传导功能亦逐渐恢复,但中度损伤大鼠恢复明显较重度损伤大鼠好,组织病理及免疫组化观察显示脊髓损伤后有胶质瘢痕及囊腔形成,但重度损伤组的组织损伤程度较中度组重,且残留正常组织较少,电镜下观察显示脊髓损伤后损伤部位可见明显出血、水肿,中性粒细胞浸润,胶质细胞染色质边集.脊髓损伤后2周可见线粒体空泡化,轴突变性,周围水肿.脊髓损伤后8周可见髓鞘变性,胶原原纤维沉积. 结论 本实验模型能将不同打击力度造成的损伤区分开,且和行为学、神经电生理、病理学等结果吻合,说明此模型具有良好的稳定性、重复性和一致性.胶质瘢痕及囊腔的形成是脊髓损伤的标志性病理变化,GFAP或Vimentin染色可作为判断其界限的标志性分子.