NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达

目的构建核呼吸因子-1（NRF-1）基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2（2-1）。方法：利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6．3-NRF-1．IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）,然后用杀稻瘟素（blasticidin）筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果：收集的重组慢病毒滴度为5．5×10^7TU／ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2．25倍。结论：本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2（2-1）中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。     

αB-晶状体蛋白与凋亡相关蛋白相互作用抑制C2C12细胞凋亡

目的 探讨aB-晶状体蛋白抗心肌细胞凋亡的分子机制。方法构建带6个串联组氨酸的aB-晶状体蛋白表达质粒(pcDNA3.1一aBC)，经测序证实后，转染C2C12肌原细胞株，筛选稳定高表达aB-晶状体蛋白的细胞株。采用H2O2(0.5mmol/L)诱导细胞凋亡，检测线粒体细胞色素C释放率和细胞膜磷脂酰丝氨酸细胞色素荧光     

Krüppel样因子4对阿霉素诱导大鼠心肌细胞H_9C_2凋亡的影响

目的探讨阿霉素对大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响及Krppel样因子4过表达对阿霉素所致H9C2细胞凋亡的影响。方法采用台盼蓝染色检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting检测Krppel样因子4及凋亡相关基因多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的表达。结果阿霉素能够诱导H9C2细胞凋亡,采用5μmol/L阿霉素处理时,24h变化最为明显;Krppel样因子4过表达之后,细胞凋亡率较转空载体组更高,达87.90%。阿霉素能够诱导Krppel样因子4在H9C2细胞中表达增加;Krppel样因子4过表达组多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶裂解片段的表达水平明显上调。结论Krppel样因子4能够促进阿霉素诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡,其作用机制与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶有关。     

人心肌热休克蛋白27基因克隆及其高表达对大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用

目的克隆和重组人心肌热休克蛋白27(HSP27)基因,观察HSP27高表达对大鼠心肌细胞氧化应激的影响。方法将RTPCR获得的人心肌HSP27基因全长cDNA,重组入质粒载体pCDNA31 。将重组体pCDNA31 /HSP27转染大鼠心肌细胞系H9c2,经G418选择性培养获得稳定转染细胞系;观察HSP27高表达对H2O2诱导的乳酸脱氢酶(LDH)释放和细胞凋亡的影响。结果(1)pCDNA31 /HSP27在293T和H9c2中表达良好;(2)0、100、250、500、1000μmol/LH2O2引起的LDH释放,在HSP27高表达组和野生型组分别为0396±0017和0390±0009、0437±0014和0416±0015、0471±0018和0417±0009、0505±0030和0657±0022、0547±0027和0661±0011(均为P<0001);(3)150μmol/LH2O2诱导的细胞凋亡在HSP27高表达和野生型组分别为总细胞数的(10693±1122)%和(4027±1628)%,P<001。结论人心肌HSP27基因被成功克隆和重组,其在大鼠心肌细胞系H9c2的高度表达显著保护了该细胞的过氧化损伤。     

慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的干涉缺氧诱导因子（HIF）-2α表达的慢病毒载体,并对所得产物进行鉴定。方法体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒 PCDH为模板扩增出的EF1-EGFP 均与PLKO．1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF-2α,后者与pMD2G,pSAX2共转染293 FT细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒。用其感染786-0细胞,检测细胞中GFP表达情况。结果成功扩增出干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段,酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2α质粒构建成功。转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2α表达的慢病毒载体。     

热诱导延迟损伤大鼠心肌细胞凋亡机理的探讨

目的探讨热诱导延迟过氧化氢(H2O2)造成大鼠心肌细胞凋亡机理。方法体外培养大鼠乳鼠心肌细胞同时温度诱导细胞产生热休克蛋白70(HSP70)，用H2O2造成心肌细胞损伤。采用Western Blottmg、流式细胞仪、Bcl-2原位杂交、免疫组化检测Caspase-3等作为检测指标，观察心肌细胞损伤，以及HSP70对心肌细胞的保护作用。结果温度诱导后HSP70在胞浆中大量表达，保护组凋亡率显著低于损伤组，Bcl-2和Caspase-3在损伤组大量表达。结论HSP70可延迟细胞凋亡，对心肌细胞具有保护作用。     

Kr(u)ppel样因子4对阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响

目的 探讨阿霉素对大鼠心肌细胞H9C2 凋亡的影响及Kr(u)ppel样因子4过表达对阿霉素所致H9C2细胞凋亡的影响.方法 采用台盼蓝染色检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting检测Kr(u)ppel样因子4及凋亡相关基因多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的表达.结果 阿霉素能够诱导H9C2细胞凋亡,采用5 μmol/L阿霉素处理时,24 h变化最为明显;Kr(u)ppel样因子4过表达之后,细胞凋亡率较转空栽体组更高,达87.90%.阿霉素能够诱导Kr(u)ppel样因子4在H9C2细胞中表达增加;Kr(u)ppel样因子4过表达组多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶裂解片段的表达水平明显上调.结论 Kr(u)ppel样因子4能够促进阿霉素诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡,其作用机制与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶有关.     

热休克蛋白70对大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

目的　探讨热休克蛋白 70 (HSP 70 )对大鼠心肌细胞凋亡的保护作用。方法　体外培养大鼠心肌细胞同时温度诱导细胞产生HSP 70 ,用过氧化氢 (H2 O2 )造成心肌细胞损伤。采用免疫组化 ,DNALadder,流式细胞仪 ,细胞色素C氧化酶比活力的测定 ,电镜观察等作为检测指标。结果　温度诱导后HSP 70在胞浆中大量表达 ,损伤组与保护组凋亡率、细胞色素C氧化酶比活力差异有显著意义 (P <0 .0 1)电镜观察损伤组细胞的细胞膜、细胞器损伤明显 ,并出现凋亡小体。结论　HSP 70可延迟细胞凋亡 ,对心肌细胞具有保护作用     

LentiviralHGF的构建及其体外对β2m-/Thy-1＋ BDLSCs影响的

目的构建携带大鼠HGF基因的慢病毒载体,并观察慢病毒对体外分选的β2m-/Thy-1＋BDLSCs转染效果及影响。方法采用RT-PCR法从大鼠肝脏中提取HGF基因,并将其克隆到穿梭质粒TG006,与包装质粒一起在293T细胞中重组产生LentiviralHGF慢病毒。通过免疫磁珠法体外分选出β2m-/Thy-1＋BDLSCs;采用荧光显微镜检测LentiviralHGF对BDLSCs的转染效率;采用ELISA法检测大鼠HGF的蛋白分泌水平;采用MTT法和免疫荧光法分别检测病毒对增殖和分化的影响。结果从纤维化大鼠肝脏中成功克隆出HGF基因,并构建LentiviralHGF慢病毒;慢病毒能高效转染BDLSCs。转染慢病毒的BDLSCs向胞外分泌高浓度的HGF。转染LentiviralHGF后,细胞增殖能力提高,ALB表达阳性。结论LentiviralHGF能高效转染BDLSCs,两者结合为肝纤维化的研究奠定了基础。     

Cx43基因shRNA慢病毒载体的构建及其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用

目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。     

多效蛋白基因的小干涉RNA慢病毒表达载体的构建及其对人小细胞肺癌H446细胞株生长与凋亡的影响

目的 构建针对多效蛋白(pleiotrophin,PTN)基因的小干涉RNA(siRNA)慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长和凋亡的影响.方法 设计4对针对PTN基阒的小发夹RNA(shRNA)序列,与Plvthm载体连接,构建慢病毒表达载体LV(lentiviral)-shPTN,连接产物转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆测序鉴定.再用LV-shPTN与pRsvREV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,小量包装与纯化产生慢病毒颗粒.感染H446细胞后,用荧光定量PCR及Western blot法检测PTN的表达.将包含对PTN基因十扰效率最高的序列慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定,将包装好的病毒感染H446细胞.实验分为正常未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组、化疗组及PTN抑制加化疗组,四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞生长,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果 测序结果与构建慢病毒载体的预期结果一致,对PTNmRNA的最高抑制效率为72%,对PTN蛋白的最高抑制效率为59%.大量包装与纯化后病毒滴度为1×10~8 TU/ml.PTN基因抑制组H446细胞活力明显低于正常未干扰细胞组和阴性对照组,基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降,凋亡率增高,并具有浓度依赖性.结论 构建PTN RNA干涉载体,转染后可有效降低H446细胞FIN的转录和表达,抑制H446细胞的生长并促进其凋亡,有望成为小细胞肺癌基因治疗的可选择的方法之一.     

弓形虫ROP16蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的 探讨弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白在人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期及凋亡方面的作用。方法 以空载体(MCF-7-HBLV)和过表达ROP16蛋白的慢病毒(HBLV-RH ROP16)分别感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达ROP16的细胞株,Real time PCR、Western blot法检测MCF-7细胞中ROP16 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡。Western blot法检测细胞周期及凋亡相关蛋白表达。结果 相比MCF-7-HBLV(空载体组)和MCF-7细胞组(对照组),MCF-7-RH ROP16细胞组中ROP16 mRNA和蛋白表达升高;细胞增殖率降低(P<0.01);S期细胞比例、细胞凋亡率升高(P<0.01)。促凋亡因子Bax、P53、Caspase-9、Caspase-3及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21表达增高(P<0.01);抗凋亡蛋白Bcl-2及细胞周期蛋白A1(CyclinA1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达均下降(P<0.01)。结论 弓形虫Ⅰ型(RH)ROP1...     

热休克蛋白70对氧化应激所致核仁素裂解的影响

为探讨热休克蛋白70对氧化应激(0．5mmol／L过氧化氢)所致核仁素裂解的影响及其机制，采用免疫印迹技术检测氧化应激诱导核仁素的裂解；通过热休克反应和构建热休克蛋白70转基因细胞观察热休克反应与热休克蛋白70对核仁素裂解的影响，同时采用免疫共沉淀技术检测热休克蛋白70与核仁素之间的相互作用。结果发现，0．5mmol／L过氧化氢可导致多种细胞的核仁素发生裂解(有80kDa裂解片断出现)，而且最早出现裂解片段的时间都在过氧化氢处理30min到lh左右；热休克预处理及转热休克蛋白70后均引起热休克蛋白70的表达明显增加，同时显著抑制抑制氧化应激所致核仁素裂解片段的出现，免疫共沉淀结果显示在氧化应激时热休克蛋白70与核仁素直接结合，形成复合物。以上结果提示，热休克反应与热休克蛋白70可以显著抑制氧化应激所致核仁素的裂解，其机理与氧化应激时热休克蛋白70与核仁素直接结合有关。     

Polaprezinc protects human colon cells from oxidative injury induced by hydrogen peroxide: relevant to cytoprotective heat shock proteins

INTRODUCTION Polaprezinc [N-(3-aminopropionyl)-L-histidinato zinc], an antiulcer drug, is a chelate compound consisting of zinc ion, L-carnosine, dipeptide of β-alanine, and L-histidine and has an antioxidant effect and anti-H pylori activity[1-4]. It ha…     

Contrasting effects of HSP72 expression on apoptosis in human umbilical vein endothelial cells and an angiogenic cell line, ECV304

The effect of overexpression of heat shock protein (HSP)72 on apoptosis induced by different stimuli in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and the angiogenic cell line, ECV304, was studied. Transient overexpression of HSP72 was achieved using an adenoviral vector (Advhsp72) and apoptosis was induced by heat shock, tumour necrosis factor (TNF)-alpha with cycloheximide (CHX), lipopolysaccharide (LPS) with TNF-alpha and verocytotoxin (VT). Apoptosis induced by heat shock was reduced by HSP72 expression. However, HSP72 expression in HUVECs increased apoptosis induced by TNF-alpha/CHX, LPS and VT measured by flow cytometric analysis of propidium iodide (PI)-stained permeabilized cells. In contrast, apoptosis in ECV304 induced by the same stimuli was reduced by HSP72 expression. No difference was seen in cells transduced with a control adenoviral vector expressing beta-galactosidase. These data imply that induction of HSP72 in cells modulates responses to apoptotic stimuli, but that the nature of the response varies with the cell type. However, it is clear that in situations where apoptosis may be part of a pathological process, HSP72 induction, for example by reperfusion injury, may exacerbate the process.     

TFR和VEGF基因双顺反子慢病毒感染骨髓内皮祖细胞的研究

目的:研究转铁蛋白受体 (transferrin receptor,TFR)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的双基因共表达慢病毒载体是否能介导目的基因在中华小型猪骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）中的有效表达。方法:通过分子克隆技术构建双顺反子慢病毒表达载体pLenti-GFP-TIR;分离培养中华小型猪骨髓EPCs,用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面抗原CD31和Flk-1的表达;并利用Lipofectin 2000将含目的基因的转移质粒与pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G共转染293T细胞并进行慢病毒包装。72 h后,收集病毒上清,感染中华小型猪骨髓EPCs,并通过RT-PCR法检测TFR和VEGF基因的表达。结果:①成功地构建了双顺反子慢病毒表达载体pLenti-GFP-TIR;②FCM检测证实,分离的细胞为骨髓EPCs;包装好的慢病毒颗粒可成功地感染中华小型猪骨髓EPCs;③RT-PCR法检测表明,TFR和VEGF呈高水平的表达。结论:TFR和VEGF基因双顺反子慢病毒载体Lenti-GFP-TIR可有效地转移目的基因至中华小型猪骨髓EPCs中,并成功地表达目的基因,为进一步探讨移植细胞分子成像奠定了基础。     

慢病毒载体介导人非小细胞肺癌A549细胞Akt2基因靶向抑制

目的通过构建慢病毒shRNA表达载体,靶向抑制Akt2基因的表达,获得稳定干扰Akt2基因的细胞克隆,为进一步探讨Akt2的功能奠定基础。方法设计并合成针对Akt2靶基因的双链寡核苷酸序列,经退火、酶切、连接反应,将干扰序列插入pGCsil-GFP质粒,经感受态细胞转化、阳性克隆测序鉴定所插入的片段,经转染及慢病毒包装,收集浓缩病毒进行滴度测定,感染至人肺腺癌细胞A549,通过无菌流式细胞分选GFP强阳性细胞,并应用荧光定量PCR及Western-blot验证干扰效果。结果重组pGCsil-shAkt2-GFP质粒载体经阳性克隆测序鉴定显示插入序列与shAkt2干扰序列完全符合,测定重组慢病毒vshAkt2滴度为3E＋9TU/ml。重组慢病毒shAkt2感染A549细胞,经流式细胞术分选90.1%GFP为强阳性细胞群。通过qRT-PCR与western blot检测Akt2mRNA及蛋白表达水平,提示与正常对照组比较,shAkt2组细胞中Akt2mRNA水平下降63.39%,蛋白水平减少91.56%。结论本研究所构建的慢病毒shAkt2表达载体,能够在A549细胞内稳定、有效的抑制靶基因Akt2的表达,为深入研究Akt2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用奠定了基础。     

Lentivirus mediated shRNA interference targeting MAT2B induces growth-inhibition and apoptosis in hepatocelluar carcinoma

AIM： To investigate the effects of lentivirus vector mediated short hairpin RNA interference targeting methionine adenosyltransferase 2β gene （LV-shMAT2B） on hepatocelluar carcinoma （HCC） cells. METHODS： We constructed four plasmids of RNA interference targeting the MAT2B gene. After LV-shMAT2B was transfected with L-02 cells and two kinds of HCC cells, cell viability and proliferation were measured with MTT and [3H]thymidine assays respectively. Flow cytometry was used to assess cell apoptosis. The level of S-adenosyl methionine （SAMe） in HepG2 cells was evaluated. The expressions of cyclin D1, cyclin D2, bcl-xL and bcl-xS were detected with western blot. RESULTS： We constructed LV-shMAT2B successfully. LV-shMAT2B was safe for human normal liver cells. LV-shMAT2B caused dramatic reduction in proliferation compared with controls in HCC cells Bel-7402 （P = 0.054） and HepG2 （P = 0.031）. Flow cytometry analysis showed that cell apoptosis caused by LV-shMAT2B was greater in HCC cells Bel-7402 and HepG2 than in control induced by scrambled siRNA （P = 0.047）, but apoptosis rates in L-02 induced by LV-shMAT2B and scrambled siRNA respectively had no significant difference. Moreover, LV-shMAT2B significantly suppressed expression of MAT2B leading to growth-inhibition effect on HCC cells by down-regulating cyclin D1. Apoptosis induced by LV-shMAT2B was involved indown-regulating bcl-xL and up-regulating bcl-xS. CONCLUSION： LV-shMAT2B can induce cell apoptosis and growth-inhibition in HCC cells. MAT2B may be a therapy target in HCC in the future.