抗人脑胶质瘤单克隆抗体SZ—39重链可变区基因的克隆与序列分析

从抗人脑胶质瘤单克隆抗体杂交瘤细胞中抽提总RNA，经逆转录-聚合酶链反应（RT－PCR）直接扩增出348bp的重链可变区（VH）CcNA片断，经核着酸序列分析研究，证实已获得了单抗SZ－39重链可变区基因。从而为今后进一步制备基因工程抗体打下了基础。     

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( ),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.     

原核细胞表达抗CD_3工程抗体

用RT—PCR方法 ,从分泌抗人CD3抗体的杂交瘤细胞中扩增抗体的重链和轻链可变区基因 ,并运用重叠延伸拼接法 (SOE)将其连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并克隆于带有Tac启动子的原核表达载体中 ,用斑点杂交方法筛选出阳性克隆。重组子在E .coilB1 2 1 (DE3)中获得高效表达且具有活性的单链抗体。     

单克隆抗体的基因工程

本文介绍了抗体基因工程的最新进展,其中包括用聚合酶链反应(PCR)从杂交瘤或非免疫细胞基因库快速克隆抗体可变区(V区)基因、互补决定区(CDR)移植V区基因的设计和构建、Fv和单链Fv片段的构建等方法以及载体扩增在哺乳动物细胞或大肠杆菌中高效表达抗体及其片段的技术等。     

单克隆抗体的基因工程

本文介绍了抗体基因工程的最新进展，其中包括用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从杂交瘤或非免疫细胞基因库快速克隆抗体可变区（Ｖ区）基因，互补决定区（ＣＤＲ）移植Ｖ区基因的设计和构建，Ｆｖ和单链Ｆｖ片段的构建等方法，以及载体扩增在哺乳动物细胞或大肠杆菌中高效表达抗体及其片段的技术等。     

鼠抗人CD3噬菌体基因工程单链抗体的初步制备

本研究应用PCR方法，从小鼠杂交瘤细胞中扩增鼠抗人CD3抗体重、轻链可变区基因，经DNA接头连接后与噬菌粒pCANTAB5重组；转化大肠杆菌形成抗体可变区基因文库。通过文库的“抢救”、亲和筛选、再转染、克隆化及鉴定，得到高亲和力鼠抗人CD3噬菌体基因工程单链抗体。     

用PCR检测淋巴结细胞基因重排对淋巴细胞增殖病的诊断意义

采用聚合酶链反应体外基因扩增技术检测１０例淋巴细胞增殖病活检淋巴结细胞免疫球蛋白重链和Ｔ细胞受体γ基因重排，与组织病理和免疫表型分析方法进行了比较。结果：６例病理诊断为非何杰金淋巴瘤者中，４例发生相应的免疫球蛋白重链或Ｔ细胞受体γ基因克隆性重排，与免疫表型分析一致、另２例同时发生免疫球蛋白重链和Ｔ细胞受体γ基因双重重排。２例病例诊断为坏死性淋巴结炎者，免疫表型分析起源于Ｂ细胞，均检测到免疫球蛋白重链基因克隆性重排，证明系克隆性恶性Ｂ淋巴细胞增殖。表明用聚合酶链反应检测免疫球蛋白重链和Ｔ细胞受体γ基因重排，对恶性淋巴细胞增殖病诊断的敏感性和特异性高于组织病理学和免疫表型分析。     

抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库的构建

目的构建抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库。方法从B-淋巴细胞刺激因子免疫小鼠的脾细胞中抽提总RNA,经逆转录聚合酶反应合成cDNA,分别扩增小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因。通过重叠延伸拼接法将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成单链抗体基因,重组于载体pFUSE5,电转化E.coliXL 1-Blue。在辅助噬菌体援救下,构建成噬菌体单链抗体库。采用聚合酶链反应、核苷酸序列测定和酶联免疫分析鉴定单链抗体库的特征。结果本抗体库的噬菌体库容量约1×106,单链抗体基因插入效率为93%,存在序列差异性并含有抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体。结论成功地构建了抗人B-淋巴细胞刺激因子单链噬菌体抗体库,为筛选抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体药物奠定了良好的基础。     

用遗传工程方法制备单克隆抗体

将小鼠杂交瘤的重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区联结,产生的分子具有同原来小鼠抗体相同的特异性,但恒定区具有人免疫球蛋白的功能.由于这些分子大部分具有人特性,因此它们对人体引起不良反应的可能性要比全鼠分子小,从而提供了一组新的诊断和治疗试剂.     

PCR在恶性血液病分子检测中的应用

PCR及其衍生技术具有操作简便、快速，灵敏度高等优点，因此，在白血病、淋巴瘤等恶性血液病的免疫球蛋白重链（IgH）基因重排、染色体易位和融合基因形成、原癌基因及抑癌基因等分子检测中得以广泛应用，对于疾病的诊断、疗效监测、预后判断等具有重要的意义。１PCR在免疫球蛋白重链（IgH）基因重排检测中的应用每一种白血病细胞仅有一种IgH基因重排方式，所以是淋巴细胞系单克隆增殖的特异性分子标志物。利用PCR及其衍生技术检测IgH基因重排，敏感而特异，是进行疗效监测、判断预后、预防复发的重要技术手段。Yokohama等犤１犦应…     

乳腺癌浸润淋巴结αT细胞受体谱型偏移分析

目的应用多重PCR方法扩增TCRα链全长序列,分析乳腺癌浸润淋巴结αT细胞受体谱型偏移。方法选取乳腺癌转移淋巴结,提取RNA后逆转录,多重PCR扩增TCRα链全长序列,构建重组质粒并澳4序,利用网上TCR资源分析序列。结果2例患者各扩增出3个α链序列。乳腺癌TCRα限制性取用AV1、AV12亚家族。CDR3区序列分析增生T细胞克隆具有不同的氨基酸序列。结论乳腺癌浸润淋巴结扩增的TCR家族存在限制性取用,克隆性增生T细胞CDR3序列不同。     

人源Fab段噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选

[摘要] 目的： 构建大容量人源Fab噬菌体抗体库及筛选特异性抗体 方法：采集18位成人外周血,分离淋巴细胞,细胞室培养淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA,用PCR扩增Fab段抗体基因,用试剂盒回收纯化抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源Fab噬菌体抗体库,用限制性内切酶鉴定基因的插入。用抗原IL-4对抗体库进行筛选。五轮筛选后,随机挑取30个单克隆用Phage ELISA和酶切进行检测。并且对阳性克隆DNA的序列进行测定。结果：构建的人源Fab噬菌体抗体库库容为2.4×108 ,酶切鉴定插入基因片段大小正确,ELISA鉴定阳性克隆有抗原结合活性。测序结果证实为为人免疫球蛋白可变区基因。结论：构建了大容量人源Fab噬菌体抗体库,从中筛选出抗IL-4人源Fab抗体,有望为获得其他抗体提供源泉,为疾病的诊断与治疗打下基础     

脂联素单链抗体基因的克隆及表达

目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。     

大鼠β细胞素的基因克隆和序列分析

目的 从大鼠肾组织充隆β细胞素基因的全部编码区，测定并分析基基因序列。方法 利用RT-PCR方法，扩增大鼠β细胞素基因片段，将基因片段插入pMD18-T载体，限制性内切酶酶切鉴定，测定序列。结果 从大鼠肾组织中成功扩增β细胞素基因，BLAST分析与GeneBank公布的β细胞素基因编码区一致。结论 从肾组织中成功克隆β细胞素全部编码区的cDNA。     

鸡-人嵌合抗体表达载体的构建

由于鸡与哺乳动物亲缘关系较远，因此，可以对一些高度保守的哺乳动物分子产生烈强的抗体应答。而且鸡可通过DNA重组、基因转移而产生具有不同型别的抗体库。鸡抗体重链和轻链的基因座仅含有单一功能可变区和连接区基因，通过一对引物就可扩增可变区基因库。但是由于鸡抗体对人体具有免疫原性，因此其临床应用受到限制。     

重组β-干扰素上调HepG2细胞表达基因抑制性消减杂交技术筛选

目的利用抑制性消减杂交技术筛选重组β-干扰素（IFN-β）上调HepG2细胞表达基因。方法以重组IFN-β 2 000 U·mL^-1刺激对数生长期HepG2细胞，设经0.9%氯化钠注射液作用的HepG2细胞为阴性对照组；制备HepG2细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录合成cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与阴性对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行基因文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建了重组IFN-β作用HepG2后差异表达的cDNA消减文库。扩增后得到50个200～1 000 bp插入片段的克隆，随机挑选其中31个插入片段测序，通过生物信息学分析获得其全长基因序列，共获得20种编码基因，其中1种为未知功能的新基因。结论通过该方法可筛选得到IFN β作用于HepG2细胞后上调表达的部分基因，包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。     

抗CD_3单链抗体的构建及核酸序列分析

目的探讨用抗CD3抗体重链可变区与轻链可变区基因,经重叠延伸拼接连接形成单链抗体。方法用DNA序列分析及动态模拟构象分析,并与相关软件分析,推导Scfv基因编码的氨基酸序列。结果该基因全长732bp,三维构象稳定,兼容性分数S>0。将单链抗体基因克隆于载体中,在强启动子作用下,目的蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论重链可变区与轻链可变区经短肽连接而成的单链抗体,具有分子量小,免疫原性低的特性,具有较广的应用前景。     

sKDR真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

研究获取可溶性血管内皮生长因子受体2(sKDR)基因构建sKDR的真核表达载体,观察sKDR对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响.方法提取HUVECs总RNA,利用RT - PCR方法扩增KDR胞外免疫球蛋白1-3区基因片段,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1中,测序鉴定基因序列正确后,用脂质体法将重组质粒p...     

电鳐乙酰胆碱酯酶单链抗体基因的克隆及表达(英文)

目的　欲用计算机模拟及分子对接技术揭示抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体 3F3抑酶的分子基础 ,但 3F3分子远大于乙酰胆碱酯酶 (AChE) ,难以操作 ,故拟用其单链抗体为工具进行研究。本研究旨在设计、克隆并表达抗AChE单链抗体Sc3F3基因 ,推演重组单链抗体的氨基酸顺序 ,并证明纯化的重组单链抗体有抑制AChE的作用。方法　使用分泌抗电鳐AChE单克隆抗体 3F3(3F3Ab)的杂交瘤细胞提取总RNA。用RT PCR技术扩增重链可变区 (VH)cDNA及轻链可变区 (VL)cDNA基因 ,通过连接肽(Gly4 Ser) 3 基因将VH 基因和VL 基因连接 ,制成单链抗体基因 (ScFv)。将ScFv基因插入载体pCANTAB 5E用于表达。在大肠杆菌中表达的 3F3单链抗体(Sc3F3)用SephadexG75凝胶过滤和QAE SephadexA 5 0离子交换层析纯化。AChE与抗体的免疫反应性用ELISA法测定。AChE活性用微量羟胺比色法测定。结果　测序结果证明所克隆的ScFv基因是功能重排基因 ,长度为 72 3bp。重、轻链基因长度分别为 35 7bp和 32 1bp。ScFv基因 (含连接肽基因 )所编码的纯化的重组Sc3F3的分子量为 31.6ku。Sc3F3与AChE反应良好 ,但对AChE活性的抑制明显弱于 3F3Ab。Sc3F3的抑制效力约为 3F3Ab的 1/10。结论　在计算机模拟及分子对接研究中使用本研究设计的单链抗体Sc3F3应是可靠的