基于液质联用技术的金铃子散亚急性毒性代谢组学

为进一步了解金铃子散毒性影响的代谢特征,探索金铃子散在治疗过程中对未知生物通路的作用。该实验通过以金铃子散3组剂量的水煎剂对大鼠肝肾的影响,来研究金铃子散对大鼠体内代谢组改变的特点和规律。首先对给药2周和给药后1周大鼠尿液和血清样本采用质谱分析方法,通过XCMS在线分析大鼠正负模式离子检测谱,对代谢谱分析的代谢物进行鉴定,结果得到44个差异性物质。最后以Met PA对液质实验中筛选出的代谢物组进行代谢通路富集和分析,结果得到:类固醇激素合成代谢途径,戊糖和葡萄糖醛酸转换,赖氨酸代谢,谷胱甘肽代谢和抗坏血酸代谢5条相关的代谢通路。由代谢网络图可以看出,与毒性相关的通路主要和生物体赖氨酸代谢、葡萄糖醛酸转化及激素代谢有关,尤其是赖氨酸和谷胱甘肽的代谢失衡,造成机体能量代谢或氧化应激调节的紊乱,产生大鼠体内的损伤。从金铃子散低、中、高3组剂量的亚急性毒性实验结果观察发现,金铃子散19.7 g·kg~(-1)和39.4 g·kg~(-1)剂量组造成了明显的毒性作用,说明金铃子散在生物体内可产生毒性作用,且毒性随着给药剂量的增加而增加,造成不可逆的机体损伤。     

基于UHPLC-MS的吴茱萸汤影响虚寒呕吐大鼠尿液代谢谱的研究

目的观察吴茱萸汤对虚寒呕吐大鼠尿液代谢谱的变化,探讨其治疗虚寒呕吐证可能的作用机制。方法运用复合法(大黄+顺铂)制备大鼠虚寒呕吐模型,将大鼠随机分为对照组、模型组、吴茱萸汤组。利用超高液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)技术结合主成分分析、偏最小二乘分析等方法对尿液数据进行分析,鉴定出潜在生物标志物,通过VIP及非参数检验筛选并通过多元化ROC曲线验证差异代谢物;运用PathwayAnalysis数据库对差异性代谢物进行拓扑分析;运用R和Cytoscape进行代谢产物的相关性分析和模块化分析。结果尿液代谢谱对照组和模型组完全分离,吴茱萸汤组靠近对照组,表明模型复制成功,且吴茱萸汤能够干预大鼠的虚寒呕吐症状,提示大鼠机体具有恢复到正常状态的趋势。从尿液中筛选出34种差异代谢物进行通路分析,发现虚寒呕吐发挥干预作用可能与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,精氨酸和脯氨酸代谢,色氨酸代谢,酪氨酸代谢,花生四烯酸代谢,三羧酸循环(TCA循环)等通路有关;进行模块化分析发现10个模块之间关系密切,丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸、琥珀酸、丙氨酸、富马酸、苹果酸、异柠檬酸等生物靶点可作为虚寒呕吐模型的标识。结论吴茱萸汤能够改善虚寒呕吐模型的生理特征,机制可能与吴茱萸汤调节大鼠体内紊乱的氨基酸代谢、能量代谢及脂代谢等有关。     

干寒环境对大鼠尿液与血浆代谢成分的影响

目的:通过核磁共振氢谱(~1H-NMR)分析方法探讨干寒环境及饮食对大鼠尿液和血浆代谢物的影响,寻找可能的生物标记物及其相关代谢途径。方法:利用干寒环境及饮食作为应激源干预大鼠3周,采集其尿液和血浆样本,检测~1H-NMR,结合多变量数据分析方法筛选与鉴定相关代谢标志物,并分析代谢通路。结果:干寒属性环境及饮食导致尿液23种代谢物,血浆中15种代谢物发生了显著变化;这些代谢物与多种代谢通路的变化密切相关,包括三羧酸循环,丙酮酸代谢,糖酵解或糖异生,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,组氨酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路。结论:干寒环境及饮食条件可导致体内多种代谢通路的变化,基于~1H-NMR的代谢组学研究方法具有解释机体病理生理动态性,整体性变化的优势,对于探索非确定性疾病因素发病机制有着重要的意义。     

基于尿液代谢组学的冠心病血瘀证模型大鼠生物学基础研究

目的研究冠心病血瘀证模型大鼠尿液代谢组学特征,探讨其潜在的生物学基础。方法将20只SD大鼠随机分为假手术组和冠心病血瘀证模型组。采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法制备冠心病血瘀证模型。利用超高效液相色谱-质谱联用技术检测假手术组和冠心病血瘀证模型组尿液样本小分子内源代谢物,进行主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析,筛选潜在生物标志物与显著代谢通路。结果与假手术组比较,冠心病血瘀证模型组有36种差异代谢产物水平紊乱,涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,磷酸戊糖途径,糖酵解/糖异生,泛酸和辅酶A生物合成,柠檬酸盐循环,丙酮酸代谢,嘌呤代谢,甘油脂代谢,戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化等多条显著代谢通路。结论冠心病血瘀证模型大鼠尿液代谢组学出现改变,其病理机制主要涉及能量代谢失衡,以及氨基酸代谢、糖代谢、嘌呤代谢紊乱及脂质堆积等多个层面。     

骨碎补醇提物对骨质疏松预防作用的大鼠尿液UPLC-MS/MS代谢组学研究

目的:研究糖皮质激素性骨质疏松大鼠尿液的UPLC-MS/MS代谢物谱变化以及骨碎补醇提物对其的干预作用,探讨液质联用技术在中药代谢组学研究中的应用。方法:采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术对正常对照组、骨质疏松模型组、骨碎补给药组大鼠尿液代谢物谱进行分析测定,并对数据进行主成分分析(PCA)以鉴别尿液中代谢产物的变化。结果:正常对照组、骨质疏松模型组、骨碎补给药组得到明显分离,发现了肌酸酐、色氨酸、苯丙氨酸、甲酚硫酸盐、柠檬酸、壬二酸等9个潜在的生物标志物。与正常对照组相比,模型组大鼠尿液中肌酸酐、柠檬酸、壬二酸、马尿酸、色氨酸以及吲哚硫酸盐含量显著下调;苯丙氨酸、甲酚硫酸盐及苯乙酰甘氨酸含量显著上调。结论:骨碎补醇提物可以调节骨质疏松大鼠体内的代谢紊乱,其作用机制可能与调节能量代谢、肠道菌代谢、氨基酸代谢以及抗氧化损伤有关。     

基于NF-κB信号通路和~1H-NMR代谢组学技术研究还阳参抗炎作用机制

基于免疫印迹法(Western blot)和~1H-NMR代谢组学技术,探讨还阳参抗炎作用机制。该研究给予雄性SD大鼠水提取物(2.5 g·kg~(-1))、醋酸地塞米松(6.25×10~(-4) g·kg~(-1)),连续1周,采用脂多糖(LPS)诱导炎症模型,观察大鼠全血中白细胞(WBC),嗜酸性粒细胞(EO),淋巴细胞(LY),嗜碱性粒细胞(BA),嗜中性粒细胞(NE)数目,检测血清炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6水平及肺组织NF-κB信号通路p65和p-IκBα蛋白表达,并采用~1H-NMR代谢组学技术分析大鼠血清内源性代谢产物变化规律。进一步将TNF-α,IL-1β,IL-6水平及NF-κB信号通路p65和p-IκBα蛋白与~1H-NMR代谢组学差异代谢物结合,共同探讨研究还阳参抗炎机制。结果显示还阳参水提物明显减少WBC,NE,EO数目,增加BA和LY数目,降低TNF-α,IL-1β,IL-6水平及NF-κB信号通路p65和p-IκBα蛋白的表达,有效缓解炎症症状。将其与还阳参调节的差异代谢物进行相关性分析,得到了4个显著性相关的代谢物,分别为甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、琥珀酸。还阳参抗炎机制可能与降低TNF-α,IL-1β,IL-6水平及NF-κB信号通路蛋白的表达,调控甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、琥珀酸代谢相关。     

基于代谢组学的难治性肾病综合征脾肾阳虚证尿液生物标志物筛选研究

目的研究难治性肾病综合征(RNS)脾肾阳虚证患者的尿液代谢组学特征。方法收集15例RNS脾肾阳虚证(试验组)患者和16例健康人(对照组)的尿液样本,运用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测代谢图情况,采用正交-偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行模式判别和差异代谢物筛选。结果 2组尿液代谢物谱明显不同。与对照组相比,试验组亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸水平上调,琥珀酸、马尿酸水平下调。结论 RNS脾肾阳虚证患者尿液代谢图谱发生改变,发生改变的5种代谢物可能为该病证的生物标志物,差异代谢物提示机体出现氨基酸代谢、三羧酸循环紊乱及肝肾功能异常。     

基于UPLC-MS的吴茱萸汤对虚寒呕吐大鼠血清代谢谱的影响

目的 以虚寒大鼠为模型，观察吴茱萸汤对模型大鼠血清代谢谱的影响，探讨其治疗虚寒呕吐证可能的内在作用机制。方法 采用复合法（大黄+顺铂）制备虚寒呕吐模型。通过超高液相色谱-质谱（UPLC-MS）技术非靶向获取虚寒呕吐大鼠血清的高通量代谢组数据，结合多元变量分析和数据库检索，对不同组别大鼠血清中内源性代谢物进行分析，筛选鉴定出潜在的差异代谢物，并通过Metabo Analyst软件进行代谢通路分析。结果 血清代谢谱对照组和模型组完全分离，吴茱萸汤给药组靠近对照组，表明从机体内源性物质变化的水平模型复制成功，且吴茱萸汤在一定程度上能够干预大鼠的虚寒呕吐症状，提示吴茱萸汤干预后机体具有恢复到正常状态的趋势。对筛选出来的35种差异性代谢物进行通路分析，发现虚寒呕吐证的机制可能与体内脂代谢、氨基酸代谢通路异常相关，且吴茱萸汤对其通路可能具有调控作用；网络模块化分析发现7个模块之间关系密切，焦谷氨酸、花生四烯酸、5-羟基色胺、异柠檬酸、三酰甘油等生物靶点可作为虚寒呕吐证的生物标志物。结论 吴茱萸汤能够改善虚寒呕吐模型的生理特征，机制可能与吴茱萸汤调节虚寒呕吐大鼠体内紊乱的氨基酸代谢、能量代谢、脂代谢等异常有关。     

基于~1H-NMR代谢组学的酸枣仁改善失眠大鼠睡眠作用机制研究

目的利用氢核磁共振(~1H-NMR)代谢组学技术研究酸枣仁对对氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠大鼠血清内源性代谢物的影响,探讨酸枣仁改善睡眠的作用机制。方法大鼠ipPCPA溶液(400mg/kg)制备失眠模型,采用1H-NMR代谢组学技术,以主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析方法为手段,对各组大鼠血清代谢物进行分析,筛选出潜在生物标志物;借助MatPA分析构建潜在靶标代谢通路和代谢网络。结果 1H-NMR代谢组学分析方法共筛选11种与失眠相关的潜在生物标志物;通过MatPA分析得到8条潜在靶标代谢通路,包括谷氨酸和谷氨酰胺代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙酮酸代谢,色氨酸代谢,三羧酸(TCA)循环。酸枣仁中剂量(15 g/kg)和高剂量(30 g/kg)均可显著回调11种潜在生物标志物。结论酸枣仁可通过调控失眠大鼠的能量代谢和氨基酸代谢,使大鼠内源性代谢物趋近正常水平,为进一步阐明酸枣仁改善睡眠的作用机制提供依据。     

基于GC-MS代谢组学的金欣口服液治疗RSV感染的体外研究

目的:通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析Hep-2细胞内源性代谢产物的相对含量变化,阐明金欣口服液体外抗RSV感染的作用机制。方法:RSV感染接种于6孔板上的Hep-2细胞,予金欣口服液治疗,24 h后予以液氮淬灭细胞,先后加入水-甲醇-氯仿(v:v:v,1:8.1:0.9)以便取少量细胞悬浮液行蛋白定量和萃取细胞代谢物,运用GC-MS检测细胞样品内源性代谢物及其相对含量的变化,并分析其可能参与的代谢通路。结果:RSV感染的细胞样本中共测得29种内源性代谢产物,其中谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、甘氨酸、柠檬酸、乳酸等为差异代谢产物(P0.05),主要与谷氨酰胺、甘氨酸、丙酮酸代谢通路有关。结论:金欣口服液体外治疗RSV感染的机制可能与调节RSV感染后引起的代谢紊乱有关。     

穿山龙抗急性痛风性关节炎的肝脏代谢组学研究

该研究通过肝脏代谢组学研究从肝论治痛风的科学性以及穿山龙提取物对急性痛风性关节炎模型大鼠的防治作用,并找到其相关的潜在生物标志物和相关代谢通路。课题组采用尿酸钠(MSU)诱导的急性痛风性关节炎模型并运用UPLC-TOF-MS结合模式识别方法探讨穿山龙提取物干预急性痛风性关节炎的潜在生物标志物及其相关代谢通路。鉴别出了11个共同的潜在生物标志物,其中穿山龙对正常大鼠的潜在干预靶点中,4个上调,4个下调;穿山龙对急性痛风性关节炎模型大鼠的潜在干预靶点中,5个代谢物在MSU诱导下被上调,5个代谢物被下调,而穿山龙提取物表现出纠正磷酸腺苷、5-甲基四氢叶酸、氧化型谷胱甘肽、次黄嘌呤、二十二碳六烯酸、谷胱甘肽、尿苷二磷酸葡萄糖、肌苷这8个代谢物异常表达的趋势,其相关性最强的代谢通路是谷胱甘肽代谢、淀粉与蔗糖代谢和嘌呤代谢。故推测穿山龙可以通过干预急性痛风性关节炎状态下和生理状态下肝脏中内源性代谢产物变化,实现防治急性痛风性关节炎作用。     

肉豆蔻-8散对心肌缺血再灌注损伤预保护作用的代谢组学分析

目的:研究心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠经肉豆蔻-8散给药后尿液中内源性代谢物的变化,探讨MIRI的发病机制以及药物预保护作用机制。方法:大鼠随机分为假手术组(0.5%羧甲基纤维素钠溶液,10 m L·kg-1),模型组(0.5%羧甲基纤维素钠溶液,10 m L·kg-1)和肉豆蔻-8散组(5.4 mg·kg-1)。采用超高效液相色谱联用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive-MS)技术表征3组大鼠尿液代谢物,使用SIMCA 14.1软件进行多元统计分析,筛选潜在生物标志物。结果:经正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),模型组与假手术组、肉豆蔻8-散组明显分离,肉豆蔻-8散组与假手术组部分区域重叠。共筛选出8个与MIRI相关的生物标志物,与氨基酸代谢、脂肪酸代谢相关。结论:肉豆蔻-8散能有效调节与MIRI模型大鼠尿液代谢有关的氨基酸代谢和脂肪酸代谢失衡,通过多通路、多途径对MIRI起到预保护作用。     

基于1H-NMR代谢组学的豨莶草水洗脱部位致大鼠肺损伤作用机制分析

目的:应用代谢组学分析豨莶草水洗脱部位(SWES)致大鼠血清和肺脏中内源性代谢产物的动态变化,探讨其造成肺损伤的可能作用机制,寻找肺损伤的敏感标志物。方法:将SD大鼠随机分为3组,即正常组(生理盐水)和SWES高、低剂量组(给药剂量分别为0.500,0.125 g·kg-1·d-1),给药4周,停药2周,检测大鼠体质量,并对肺脏组织进行病理学检查。采用血清和肺脏样本进行核磁共振氢谱(1H-NMR)检测,运用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对大鼠体内代谢产物的变化进行分析。结果:SWES高剂量组大鼠出现肺脏炎症,停药2周后呈可逆性改变。SWES高剂量组与正常组代谢谱差异区分显著。血清和肺脏中共鉴定出11个差异性代谢产物,其中血清4个(乙酸、氧化三甲胺、甘氨酸、肌肉肌醇),肺脏9个(乳酸、乙酸、磷脂酰胆碱、丙酮酸、二甲胺、谷氨酸、甘油磷酸胆碱、甘氨酸、黄嘌呤)。肺损伤涉及丙酮酸代谢、谷氨酸代谢等通路的紊乱。停药后肺脏中大多数差异代谢产物水平显著回调,与病理检测相一致。结论:SWES造成的损伤器官之一为肺脏,肺损伤呈可逆性改变,肺损伤机制与能量代谢和氧化应激反应有关。     

基于代谢组学技术的宁神灵抗抑郁作用机制研究＊

目的 采用代谢组学技术研究宁神灵抗抑郁的作用机制，确定抑郁症的生物标记物及宁神灵药效作用的关键通路。方法 参考Banasr的CUMS模型建立方法制备抑郁症大鼠模型。采用超高效液相-高分辨串联质谱（AB TripleTOF 5600⁺LC/MS/MS）系统分析抑郁症大鼠尿液代谢物含量及组成的变化，聚焦抑郁症核心生物标记物及关键代谢酶，并评价宁神灵抗抑郁的作用机制。结果 通过模式识别分析发现，抑郁症大鼠代谢发生显著差异代谢，其代谢轮廓在健康状态区域发生显著偏移。对影响代谢分布的生物标记物分析发现，主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸脯氨酸、泛酸、二羟基丙酮磷酸盐、3-羟基丁酸、肌酐、腺苷。其主要涉及氨基酰基-tRNA生物合成、氮代谢、硫胺素代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等，给予宁神灵后其含量呈回调趋势。结论 宁神灵对抑郁症有很好的治疗作用，宁神灵可能通过氨基酸代谢、糖酵解、TCA循环和ATP生物合成过程中调节发挥抗抑郁的治疗作用。     

Metabolomics study of biochemical changes in the serum and articular synovium tissue of moxibustion in rats with collagen-induced arthritis: 艾灸对胶原诱导性关节炎大鼠血清和关节滑膜组织生化改变的代谢组学研究

ObjectiveTo demonstrate the rheumatoid arthritis (RA) mechanisms by determining the biochemical changes. To investigate the therapeutic mechanism of moxibustion in RA-model rats using a gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS) metabolomics approach.MethodsA total of 24 rats were divided into three groups as follows: normal control group, model group and moxibustion group. Rats in model group and moxibustion group were set up collagen-induced arthritis (CIA) model. Rats in moxibustion group were treated by moxibustion. After 3 weeks of intervention, right ankle joint, serum and articular synovium samples were collected. Right ankle joint samples were used for histopathological evaluation between 3 groups to get the pathological changes of tissues and cells. Serum and articular synovium samples were used to analyze the changed metabolites of moxibustion on RA rats by the GC–MS based metabolomics.ResultsTreatment of moxibustion not only significantly increased the weight of CIA rats, reduced the swelling of hind paw, arthritic scores, IL-1β, TNF-α but also improved histopathological evaluation in right ankle joint samples. Sixteen significantly altered metabolites were found in RA rats as potential biomarkers of arthritis. Thirteen metabolites, significantly adjusted by moxibustion to help relieve arthritis, were selected out as biomarkers of antiarthritic mechanism of moxibustion, which were mainly involved in phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, glycine, serine and threonine metabolism, phenylalanine metabolism, alanine, aspartate and glutamate metabolism, glyoxylate and dicarboxylate metabolism and aminoacyl-tRNA biosynthesis.ConclusionsWe have indicated moxibustion treatment is able to resist inflammation in CIA rats effectively. Using GC–MS metabolomics technique, we detect novel metabolites in the moxibustion antiarthritic process, which may aid in advanced understanding of arthritis and therapeutic mechanism of moxibustion.     

Reduning Injection prevents carrageenan-induced inflammation in rats by serum and urine metabolomics analysis

Objective: To elucidate the anti-inflammatory mechanism of Reduning Injection (RDN) by analyzing the potential biomarkers and metabolic pathways of the carrageenan-induced inflammatory model from the overall metabolic level. Methods: Rat inflammatory model was established by carrageenan. UPLC-Q-TOF/MS was used to detect and analyze changes of endogenous metabolites in the serum and urine of carrageenan-induced inflammatory rats. Combined with multivariate analysis and databases analysis, inflammatory-related potential biomarkers were screened and identified to analyze possible metabolic pathways. The reliability and biological significance of these biomarkers was verified by metabolic network analysis and correlation analysis with pharmacodynamic indicators. Results: A total of 16 potential biomarkers were screened and identified by multivariate analysis and metabolite databases, among which 13 species could be adjusted by RDN. The metabolism pathway analysis revealed that histidine metabolism, sphingolipid metabolism, and tyrosine metabolism were greatly disturbed. Their biomarkers involved urocanic acid, sphingosine, and norepinephrine, all of which showed a callback trend after RDN treatment. The three biomarkers had a certain correlation with some known inflammatory-related small molecules (histamine, arachidonic acid, Leukotriene B4, and PGE2) and pharmacodynamic indicators (IL-6, IL-1β, PGE2 and TNF-α), which indicated that the selected biomarkers had certain reliability and biological significance. Conclusion: RDN has a good regulation of the metabolic disorder of endogenous components in carrageenan-induced inflammatory rats. And its anti-inflammatory mechanism is mainly related to the regulation of amino acid and lipid metabolism. This research method is conducive to the interpretation of the overall pharmacological mechanism of Chinese medicine.