低氧预适应诱导肝脏HIF-1α高表达对自体原位肝移植大鼠JNK信号转导通路的影响

目的 检测低氧诱导因子α(HIF-1α)在自体原位肝移植大鼠肝脏的表达情况,探讨HIF-1α在JNK信号转导通路中的作用机制.方法 采用单纯随机抽样法将96只SD大鼠分为正常对照组、自体肝移植组、低氧预适应+自体肝移植组,每组32只.正常对照组:仅开腹分离血管,不作其他处理;自体肝移植组:采用经门静脉灌注法建立稳定的70%自体原位肝移植模型;低氧预适应+自体肝移植组:术前用8%氮氧混合气体低氧预处理90min,其他处理同自体肝移植组.分别于术后1、2、12、24h检测大鼠血清ALT、AST水平,免疫组织化学染色法测定大鼠肝脏组织HIF-1α的表达,RT-PCR检测c-Jun mRNA表达水平,Western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白表达水平.多组比较采用方差分析,两组比较采用t检验.结果 术后1、2、12、24 h,低氧预适应+自体肝移植组大鼠血清ALT和AST水平显著低于自体肝移植组,但高于正常对照组,差异有统计学意义(F=2631.371、1177.642、810.383、682.848,743.618、1095.522、375.995、580.613,P＜0.05).自体肝移植组大鼠术后各时相点HIF-1α蛋白的表达水平明显低于低氧预适应+自体肝移植组,但均高于正常对照组,差异有统计学意义(F=191.737,284.482,459.419,213.782,P＜0.05).低氧预适应+自体肝移植组大鼠术后1、2、12 h c-Jun mRNA表达水平显著低于自体肝移植组,但均高于正常对照组,差异有统计学意义(F=66.211,53.169,9.645,P＜0.05),术后24 h c-Jun mRNA表达水平3组间比较,差异无统计学意义(F=1.100,P＞0.05).低氧预适应+自体肝移植组大鼠术后各时相点Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著低于自体肝移植组,但均高于正常对照组,差异有统计学意义(F=23.133,31.158,14.347,29.043,P＜0.05).结论 肝移植大鼠低氧预适应后HIF-1α的高表达可能通过抑制JNK信号通路的持续激活,下调Cleaved Caspase-3蛋白的表达,从而抑制肝细胞凋亡,减轻肝脏缺血再灌注损伤.     

低氧预处理对大鼠自体肝移植后胰腺的保护作用

目的探讨低氧预处理对大鼠自体肝移植后胰腺的保护作用及其机制。方法 90只大鼠随机分成假手术组(sham组,术后6h、24h、48h,每组10只)、自体肝移植组(术后6h、24h、48h,每组10只)和低氧预适应组(术前通过低氧装置给予低氧预适应90min,氧浓度为8%O2∶92%N2;12 h后行自体肝脏移植,6 h、24h、48 h,每组10只)。测定血淀粉酶、脂肪酶,了解胰腺外分泌功能;测定胰腺组织MDA的含量;光镜、电镜观察胰腺形态学改变。SP法检测HIF-1a在胰腺中的表达。结果低氧预适应组大鼠血淀粉酶、脂肪酶、胰腺组织MDA的含量与自体肝移植组比较显著降低(P0.05),光镜、电镜观察低氧预适应组大鼠组织学结构损害轻于自体肝移植组,相应时间点低氧预处理组HIF-1a表达增加(P0.05)。结论低氧预处理对大鼠自体肝移植后胰腺具有保护作用,其机制与胰腺组织HIF-1a表达增加有关。     

低氧预适应对自体原位肝移植大鼠TNF—α诱导肝细胞凋亡的保护作用及机制的研究

目的：探讨低氧预适应（HP）对自体原位肝移植大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导肝细胞凋亡的保护作用以及可能的机制。方法：采用经门静脉灌注法制备大鼠自体原位肝移植模型,将SD大鼠随机分为正常对照组（NC）、自体肝移植（AT）和AT＋低氧预适应（HP）3组。HP组术前用8％氮氧混合气体处理90min。3组分别于术后1,2,12,24h处死大鼠取肝脏标本,抽血检测肝功能,RT-PCR检测TNF-、C-Jun mRNA表达水平,透射电子显微镜下观察肝细胞的超微结构变化。     

低氧预适应对自体原位肝移植大鼠肠道TLR4表达的影响

目的：探讨低氧预适应（HP）对大鼠自体肝移植后肠道TLR4蛋白表达的影响。方法：将SD大鼠随机分为正常对照组（NC）、自体肝移植（AT）组和低氧预适应＋AT（HP）组3组,每组24只,采用改良的自体肝移植模型。HP组术前用8%氮氧混合气体处理90 min,分别于术后1、6、12 h处死大鼠取小肠标本,抽血检测血清ALT及AST水平,采用免疫组化法测定各组小肠组织TLR4蛋白表达情况,及应用逆转录-聚合酶反应（RT-PCR）检测小肠组织TNF-αmRNA的含量。结果：HP组血清ALT、AST水平,小肠组织TLR4蛋白表达及TNF-αmRNA的含量均显著低于AT组,但均高于NC组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：HP通过下调肝移植大鼠小肠组织TLR4蛋白的表达,进一步抑制TLR4信号转导通路,减少TNF-α等细胞因子的合成与释放,从而减轻对移植肝功能的损伤。     

低氧预适应对自体原位肝移植大鼠血清内毒素的影响

目的 探讨低氧预适应(HP)对大鼠自体肝移植后血清内毒素的影响.方法 采用改良的自体肝移植模型进行研究.将SD大鼠随机分为正常对照组(NC)、自体肝移植(AT)和低氧预适应+AT(HP)3组,每组24只.HP组术前用8%氮氧混合气体处理90 min.各组分别于术后1,6,12 h处死大鼠取肠标本,抽血检测ALT和AST水平;在光镜及透射电镜下观察各组小肠黏膜损伤程度及线粒体超微结构改变;同时应用ELISA试剂盒测定大鼠血清内毒素水平的变化.结果 HP组血清ALT,AST及内毒素水平均显著低于AT组,但高于NC组,差异均有统计学意义(P＜0.05);光镜下 HP组小肠黏膜损伤程度明显低于AT组;透射电镜下HP组线粒体损伤较AT组明显减轻.结论 HP可减轻肝IRI对肠道黏膜的损伤,减少了肠道内毒素移位而降低肝移植大鼠血清内毒素水平,从而减轻内毒素对移植肝功能的影响,其机制可能与减轻线粒体结构损伤,减轻缺血缺氧后线粒体功能障碍,改善细胞的供能,提高细胞的抗缺氧能力有关.     

低氧预适应对移植肝内胆管的显微及超微结构的影响

目的：探讨移植肝内胆管的显微和超微结构的变化以及低氧预适应的保护作用。方法：建立大鼠自体原位肝移植模型，30只SD大鼠随机分为3组，A组：自体原位肝移植组；B组：低氧预适应后行自体原位肝移植组；C组：假手术组。术后48h取材，检测各组血清胆红素水平，光学显微镜下观察各组胆管上皮细胞的显微结构，透射电子显微镜下观察肝内毛细胆管的超微结构。结果：A组血清胆红素水平比B组升高更明显（P〈0．01）；光学显微镜下，A组与B组相比，胆管上皮细胞损伤严重，细胞排列缺失明显，炎性细胞浸润增加；电子显微镜下，A组与8组相比，肝内毛细胆管管腔扩张明显，微绒毛肿胀、数量减少或消失的情况严重，胆汁淤积程度明显。结论：低氧预适应对移植肝内胆管具有显著的保护作用。     

低氧预适应对自体肝移植大鼠Bcl-2蛋白表达的影响及其意义

目的 探讨低氧预适应(HP)对大鼠自体肝移植后Bcl-2蛋白表达的影响及其意义.方法 采用改良的自体肝移植模型研究缺血再灌注损伤(IRI),将SD大鼠随机分为正常对照(NC)、自体移植(AT)和AT+低氧预适应(HP)3组,每组24只.HP组术前用8%氮氧混合气体处理90 min,分别于术后1,6,24 h处死大鼠取肝脏标本,抽血检测肝功能,免疫组化方法测定大鼠肝组织Bcl-2蛋白的表达,并在光镜和透射电镜下观察各组肝细胞形态学改变、线粒体损伤程度等.结果 HP组血清ALT和AST水平显著低于AT组,差异有统计学意义 (P＜0.05);HP组各时段的肝功能明显优于AT组;HP组各时段Bcl-2蛋白明显高于AT组,差异有统计学意义(P＜0.05).光镜下AT组的肝组织肿胀明显,而HP组无明显改变.透射电镜下AT组肝细胞出现典型的凋亡征象,而HP组肝细胞无明显凋亡形态;定量分析线粒体的面积、周长及直径均与AT组差异有统计学意义(P＜0.05),HP组线粒体损伤程度较AT组为轻.结论 HP对移植所导致的肝细胞凋亡有明显的抑制作用;它可能系通过上调Bcl-2蛋白的表达、减轻线粒体损伤途径而发挥其保护作用.     

低氧预适应对自体原位移植肝肝内胆管上皮细胞的影响

目的探讨低氧预适应(HP)对自体原位移植肝肝内胆管上皮细胞的影响及其机制。方法大鼠随机分为3组:A组为自体肝移植组;B组为低氧预适应后行自体肝移植组;C组为假手术组。于术后24 h 3组检测血清总胆红素(TBIL),直接胆红素(DBIL),碱性磷酸酶(ALP);免疫组织化学法检测胆管上皮细胞VEGF的表达及其核增殖指数(PI);光镜下观察胆管上皮细胞的病理变化。结果 (1)血清TBIL,DBIL和ALP检测,与C组比较,A,B组都有不同程度的升高,但A组升高更明显。(2)各组胆管上皮细胞均有VEGF表达,其中B组表达最强;与C组比较,A,B组的胆管上皮细胞都有不同程度的增生,但B组的胆管上皮细胞PI升高更明显。(3)组织学检测显示,与B组相比,A组胆管上皮细胞损伤严重,细胞排列缺失明显,炎性细胞浸润增加。结论低氧预适应对移植肝肝内胆管上皮细胞具有保护作用,其机制可能与HP能诱导移植肝肝内胆管上皮细胞过度表达VEGF有关。     

受体低氧预适应后肠黏膜改变对大鼠移植肝的影响

目的:研究低氧预适应对肠道黏膜屏障的作用以及对移植肝再灌注损伤的影响.方法:88只SD大鼠分为原位肝移植组(A组)、受体低氧预适应组(B组)和假手术组(C组)、A、B组均行原位肝移植.术后2 h检测大鼠血清肝功能和内毒素水平、肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,观察肝、肠组织细胞形态学改变以及3d和1周存活率.结果:B组肝功能损害与A组相比明显降低(P<0.01),MDA含量、血清内毒素明显低于A组(P<0.01),SOD活性明显高于A组(P<0.01);B组肝细胞结构改变较小,肠黏膜上皮损伤较轻;术后1周存活率B组较A组高(P<0.01).结论:受体低氧预适应能够保护肠黏膜屏障,减轻移植肝再灌注损伤.     

VEGF参与低氧预适应对移植肝肝内胆管上皮细胞的保护作用

目的 探讨低氧预适应(hypoxic preconditioning,HP)对移植肝肝内胆管上皮细胞的保护作用及血管内皮生长因子(VEGF)在其中的作用.方法 建立大鼠自体原位肝移植模型,实验大鼠被分为3组: 自体原位肝移植组(AT组)、HP后行自体原位肝移植组(HP组)和假手术组.各组于术后6、12、24和48 h检测血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)及碱性磷酸酶(ALP)水平,免疫组织化学法检测肝内胆管上皮细胞中VEGF的表达,光镜下观察肝内胆管上皮细胞的病理变化.结果 AT组术后血清TBIL、DBIL及ALP水平持续高于HP组(P＜0.05);各时相HP组VEGF的表达均明显高于AT组(P＜0.05);光镜下,HP组各时相肝内胆管上皮细胞损伤及炎症细胞浸润程度均较AT组明显减轻.结论 HP对移植肝肝内胆管上皮细胞有保护作用,VEGF可能在其中发挥着重要作用.     

Protective effects of deferoxamine mesylate preconditioning on pancreatic tissue in orthotopic liver autotransplantation in rats

Background

Deferoxamine mesylate is known to ameliorate tissue ischemia-reperfusion injury. This study was designed to explore the impact of deferoxamine mesylate preconditioning (DMP) on pancreatic tissue and its possible effects during orthotopic liver autotransplantation.

Methods

A modified orthotopic liver autotransplantation model was used to simulate pancreatic ischemia-reperfusion injury. Sprague-Dawley rats (0.25-0.30 kg) were randomly divided into normal control, autotransplantation (AT), systemic deferoxamine mesylate preconditioning (SDMP), and partial deferoxamine mesylate conditioning (PDMC) groups. The SDMP group was injected with deferoxamine mesylate (75-90 mg; 300 mg/kg), via the celiac artery at 24 and 48 hours before surgery. During surgery, the PDMC group underwent liver perfusion by means of deferoxamine mesylate solution (20 ml; 0.6 mmol/L) rather than Ringer's lactate solution, with no prior preconditioning. At 6, 24, and 48 hours after surgery, the rats were sacrificed to sample their pancreatic tissues for the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) and malondialdehyde (MDA) content. The samples were subjected to blood chemistry analyses, light and transmission electron microscopic morphological studies, and quantitative measurement of HIF-1α expression.

Results

The serum levels of amylase, lipase, and MDA in SDMP and PDMC groups were significantly lower than those in the AT group at 6, 24, and 48 hours after orthotopic liver autotransplantation (P < .05). Light and electron microscopic analyses showed much more severe pancreatic injury in the autotransplantation than in the SDMP and PDMC groups. The HIF-1α expression was increased in the SDMP and PDMC groups more than in the autotransplantation group (P < .05).

Conclusions

Deferoxamine mesylate preconditioning protected pancreatic tissue in orthotopic liver autotransplantation in rats. Inhibition of oxidative toxic reactions and up-regulated expression of HIF-1α protein are possible mechanisms.     

大鼠小体积肝移植物再灌注早期EGR-1的表达及其意义

目的探讨早期生长因子(EGR-1)在大鼠小体积肝移植物早期损伤中的表达及意义。方法雄性SD大鼠随机分成3组:假手术组(SO组),小体积肝移植物组(30%供肝组),全肝移植物组(100%供肝组)。采用两袖套法建立肝移植模型,比较再灌注24 h内3组肝功能指标变化、肝脏组织病理学改变及肝移植物内EGR-1和内皮素-1(ET-1)表达的变化。结果假手术组AST水平明显低于其余两组(P0.01),而100%供肝组AST水平低于30%供肝组,其中6,24 h时点上,两者差异具有统计学意义(P0.01)。光镜检查显示24 h 30%供肝的肝窦明显扩张,肝窦内衬细胞崩解、分离。假手术组未见EGR-1和ET-1表达,30%供肝组EGR-1和ET-1表达明显强于100%供肝组。结论小体积肝移植物早期损伤与EGR-1高表达及受其调控的ET-1表达上调有关。     

Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Protection of Intrahepatic Cholangiocytes Mediated by Hypoxic Preconditioning After Liver Transplantation in Rats

Objective

To investigate the effect on intrahepatic cholangiocytes mediated by hypoxic preconditioning (HP) after liver transplantation and the role of vascular endothelial growth factor (VEGF).

Materials and Methods

This experiment was based on a model of rat orthotopic liver autotransplantation. Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: normal control, autotransplantation (AT), and HP. The HP group was subjected to 8% oxygen atmosphere for 90 minutes before surgery. At 6, 12, 24, and 48 hours after autotransplantation, the rats were killed for testing .Serum total bilirubin, direct bilirubin, and alkaline phosphatase concentrations were determined. The microstructure of cholangiocytes and the ultramicrostructure of cholangioles were determined. Immunohistochemistry was used to detect the expression of VEGF and the proliferation rate of cholangiocytes.

Results

Total bilirubin, direct bilirubin, and alkaline phosphatase concentrations in the AT group increased considerably more than in the HP group during the entire interval (P < .05). Light microscopy demonstrated that the microstructure of cholangiocytes in the AT group was damaged more seriously than in the HP group. At transmission electron microscopy, the ultramicrostructure of cholangioles was changed more obviously than in the HP group. The expression of VEGF on cholangiocytes and the proliferation rate of cholangiocytes were higher in the HP group than in the AT group over the entire experiment (P < .05).

Conclusion

Hypoxic preconditioning has a protective effect on cholangiocytes after liver autotransplantation. The mechanism may be related to HP-induced overexpression of VEGF on cholangiocytes.     

缺血预处理对大鼠小体积供肝的保护作用及机制

目的探讨缺血预处理（IPC）对大鼠小体积供肝的保护作用及其机制。方法120只SD大鼠随机分为3组（每组20对）：无热缺血组（NWI）、缺血再灌注组（WI）和缺血预处理组（IPC）。用双袖套法建立大鼠小体积肝移植模型。各组10只受体大鼠于术前1d、术后1、2、3、5d取血，用自动生化分析仪检测AST和ALT。NWI组于供肝灌注前及植入后0．5、1、2、3h，WI组于热缺血前及植入后0．5、1、2、3h，IPC组于IPC前、IPC后及植入后0．5、1、2、3h取肝组织，用硝酸还原法检测其NO浓度。结果IPC可降低大鼠小体积肝移植术后血清AST和ALT浓度，提高再灌注早期肝脏组织NO的浓度，降低再灌注晚期肝脏组织NO的浓度（P〈0．05）。结论NO在大鼠肝脏的缺血再灌注损伤中可能具有双重作用。IPC对大鼠小体积供肝的缺血再灌注损伤有保护作用。其机制可能是通过促进供肝再灌注后早期NO合成，改善肝脏微循环，同时抑制供肝再灌注后晚期NO合成，减轻过量NO的损伤作用，从而保护移植肝脏功能。     

低氧预适应对自体原位肝移植大鼠p-JNK蛋白表达的影响

目的：探讨低氧预适应（HP）对大鼠自体肝移植后p-JNK蛋白表达的影响及其保护作用。方法：采用改良的自体肝移植模型,将SD大鼠随机分为正常对照（NC）组、自体肝移植（AT）组和＋AT（HP）组,每组32只。HP组术前用8%氮氧混合气体处理90min。分别于术后1、2、12和24h处死各组大鼠,每个时相点处死8只,取肝脏标本,抽血检测肝功能,免疫组织化学方法测定大鼠肝组织磷酸化的JNK（p-JNK）蛋白、细胞色素C的表达,并在透射电子显微镜下观察各组肝细胞形态学改变。结果：HP组血清ALT和AST水平显著低于AT组,差异有统计学意义（P〈0.05）;HP组各时相点的肝功能明显优于AT组;HP组各时相点p-JNK蛋白、细胞色素C的表达明显低于AT组,差异有统计学意义（P〈0.05）。透射电子显微镜下AT组肝细胞出现典型的凋亡征象,而HP组肝细胞无明显凋亡形态。结论：HP对移植所导致的肝细胞凋亡有明显的抑制作用;其机制可能是通过抑制JNK信号通路的持续激活,下调p-JNK蛋白的表达、抑制线粒体细胞色素C的释放而发挥其保护作用。