骨形态发生蛋白-2在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白-2（BMP-2）对骨髓源性心肌干细胞（MCSC）向心肌分化的作用,探讨MCSC向心肌分化中的BMP-2信号转导机制.方法从SD大鼠骨髓中筛选MCSC,用BMP-2诱导向心肌定向分化.RT-PCR检测诱导前后BMP-2受体BMPRIA和BMPRII、心肌早期转录因子Nkx2.5和GATA-4以及cTnT mRNA的表达.免疫细胞化学标记诱导后细胞cTnT和Cx-43的表达.结果用BMP-2诱导后,MCSC的形态和排列发生变化.RT-PCR检测结果显示,诱导前BMPRIA和BMPRII以及Nkx2.5和GATA-4呈低表达,诱导后1周表达增加,3～4周表达明显.cTnT mRNA在诱导前不表达,诱导后1周开始表达,3～4周表达明显.免疫细胞化学染色显示,cTnT和Cx-43从诱导后2周开始表达.3～4周cTnT表达增强,呈现密集的横纹样结构.Cx-43在2周位于细胞膜下,3周分布于相邻细胞连接处,4周呈颗粒状密集分布于肌管的相邻细胞连接处. 结论BMP-2通过BMPRIA和BMPRII的介导作用诱导MCSC分化为心肌细胞.     

5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞向心肌分化过程中心肌肌钙蛋白T的表达变化

目的研究5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化过程中,心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达变化和超微结构。方法从SD大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)中筛选MCSC,用5-氮杂胞苷诱导向心肌定向分化。取分化后不同时间的细胞作cTnT免疫细胞化学染色,并对结果进行图像分析。透射电镜下观察分化细胞的超微结构。取不同发育期和成熟期的SD大鼠心肌作对比研究。结果用5-氮杂胞苷诱导后2周,细胞内开始表达cTnT;诱导后3周,cTnT表达增强,可见横纹样结构;诱导后4周,cTnT表达明显增强,横纹增多,但排列不规则。诱导后4周的细胞内出现心房粒,可见丰富的粗面内质网和糖原。胚胎11d大鼠的心肌内,横纹样结构较少且排列不规则。新生大鼠心肌内横纹增多,排列较规则。1月龄和3月龄心肌的横纹样结构发达,排列规则。诱导分化后4周的细胞cTnT表达特征与胚胎11d的心肌相似。结论MCSC经5-氮杂胞苷诱导后可分化为心肌细胞,表现为未成熟心肌的结构和功能特征。     

心肌梗死大鼠血清促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用

 目的: 探讨急性心肌梗死（AMI）大鼠血清在体外对大鼠骨髓间质干细胞（BMSC）分化为心肌细胞的作用。方法: 将大鼠BMSC分为6组进行细胞培养：Ⅰ组为未诱导组(对照组),Ⅱ组为5-aza诱导组,Ⅲ组为5-aza＋AMI血清诱导组,Ⅳ组为5-aza＋正常大鼠血清诱导组,Ⅴ组为AMI血清诱导组,Ⅵ组为正常大鼠血清诱导组。培养30 d后进行分化细胞鉴定，检测细胞的形态变化和心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌细胞转录因子GATA-4和结蛋白（desmin）的表达。结果: 大鼠BMSC经5-aza或5-aza联合血清诱导后，向心肌样细胞分化，其cTnT、GATA-4、desmin表达阳性。对照组和单纯血清诱导组的BMSC未见形态改变，其cTnT亦为阴性，但GATA-4、desmin却呈弱阳性。另外，5-aza联合血清诱导组在诱导2周后可观察到部分细胞呈缓慢而有节律的跳动，而单纯5-aza诱导组未见细胞跳动。结论: 单纯用AMI大鼠血清不能诱导BMSC向心肌细胞分化，但AMI血清能促进5－aza诱导的BMSC向心肌细胞分化，并促进分化的心肌细胞成熟。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外心肌定向诱导及心肌组织构建研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌定向诱导分化及诱导后BMSCs体外构建工程化心肌组织的可行性。方法用含10μmol／L5-氮胞苷（5-Aza）的完全培养液（LG-DMEM,10％胎牛血清,100U／mL青霉素,100μg／mL链霉素,10μg／L碱性成纤维细胞生长因子）孵育第3代BMSCs24h后改用完全培养基培养4周,采用未处理组作为阴性对照。采用免疫细胞化学方法检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）、α-肌动蛋白（α-Actin）的表达;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测早期心肌形成转录因子GATA-4、Nkx2．5、TDGF-1基因的表达。将已诱导4周的BMSCs接种于多聚赖氨酸包被的脱细胞牛心包生物支架上培养2周后检测。结果诱导组细胞向心肌细胞转化,表达cTnT、α-Actin,对照组不表达cTnT、α-Actin;RT-PCR检测BMSCs诱导后表达早期心肌形成转录因子GATA-4、Nkx2．5、TDGF-1等基因;诱导后的BMSCs黏附于脱细胞牛心包生物支架表面,生长良好。结论大鼠BMSCs可向心肌细胞定向诱导分化,与脱细胞牛心包生物支架黏附良好,有望构建理想的组织工程化心肌。     

Smad信号通路在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用

目的研究Smad信号通路在BMP-2诱导的骨髓源性心肌干细胞（MCSCs）向心肌分化中的作用,探讨MCSCs向心肌分化的信号转导机制。方法从SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,用骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导向心肌定向分化。Western blotting和免疫细胞化学法检测诱导后细胞内磷酸化的Smadl／5／8的表达及其随诱导时间在细胞内分布的变化。RT-PCR检测诱导前后细胞内GATA-4和心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）mRNA的表达。结果BMP-2诱导后15min,细胞内可检测到磷酸化的Smadl／5／8的表达,30min-1h表达明显增加,1h后开始降低,4h呈低表达。BMP-2诱导后15min,磷酸化的Smadl／5／8仅见于胞质中,30min胞质和胞核均见表达,1h主要在胞核内表达。BMP-2诱导后2周,细胞明显表达GATA-4和cTnT mRNA。诱导后4周细胞呈现成熟心肌细胞样形态。用SB203580抑制Smad信号后,GATA-4和cTnTmRNA的表达显著降低,细胞形态变化不明显。结论Smad信号通路在BMP-2诱导MCSCs向心肌分化中发挥重要的介导作用。     

5-氮胞苷诱导体外培养的胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的研究5-氮胞苷(5-aza)体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的可行性。方法将P19细胞接种于培养板中或铺有琼脂的培养板中,5μmol/L5-aza培养7d后用不含5-aza的培养基继续培养。倒置显微镜观察细胞跳动情况,用免疫细胞化学、RT-PCR检测及电镜观察等方法鉴定细胞分化。结果5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞分化为有节律跳动的心肌细胞。分化的细胞表达心肌特异的GATA-4、α-MHC mRNA及α-sarcomeric actin、cTnT蛋白,同时透射电镜观察到细胞质内有明显的肌丝。结论5-aza在体外可诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化,悬浮培养有助于细胞的心肌化过程。     

人胚胎生殖干细胞移植对大鼠心肌梗死的影响

目的:探讨直接注射移植人胚胎生殖干细胞对大鼠心肌梗死的影响.方法:缝扎SD大鼠左冠状动脉前降支,建立心肌梗死模型.取5～10周人胚胎生殖腺嵴,组织块体外培养,生物学鉴定为人胚胎生殖干细胞(hEG).将其直接注射于大鼠急性心肌梗死边缘.于移植后1 d、1、2、4周处死大鼠,免疫组织化学方法观察心肌特异转录因子GATA-4和抗人细胞核抗体MAB1281在移植细胞的表达.结果:免疫组织化学显示移植组MAB1281检测阳性,GATA-4在移植细胞阳性表达.结论:hEG细胞直接注射移植大鼠心肌梗死处,细胞能存活并呈现向心肌细胞分化的表现,显示出正常心肌细胞的光镜结构.     

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞（ESCs）分化为心肌样细胞的诱导作用。方法 收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α－肌动蛋白（α-Actin）的表达。结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一。结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。     

CaSR在淫羊藿苷诱导的胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

 目的: 观察钙敏感受体(calcium sensing receptor,CaSR)对淫羊藿苷(ICA)诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响。方法: 129小鼠ES-D3细胞经直接悬浮法形成拟胚体(EBs),应用ICA定向诱导,透射电镜观察分化细胞的超微结构;免疫荧光和Western blot分别检测细胞有无α-辅肌动蛋白(α-actinin)和肌钙蛋白I(cTnI)的表达;流式细胞术检测细胞分化率;Western blot检测心肌特异转录因子NKx2.5、GATA-4和CaSR的蛋白表达。结果: ICA诱导2 d后,可见自发性收缩的细胞簇;随着诱导分化时间的延长,α-actinin和cTnI蛋白的表达逐渐增多;CaSR、NKx2.5和GATA-4蛋白在分化早期表达最多,持续表达至晚期;电镜观察分化细胞中可见连接结构、肌丝;CaSR激动剂新霉素能够增加早期EBs中CaSR、NKx2.5和GATA-4的表达,CaSR抑制剂NPS2390能够阻断上述作用。结论: CaSR在胚胎干细胞分化的心肌细胞中有表达,CaSR活化可通过增加NKx2.5和GATA-4的表达促进心肌细胞的分化。     

应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的 探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征.方法 将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs).将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α一横纹肌肌动蛋白(asarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、a-MHC基因表达,鉴定细胞分化.结果 将5-aza诱导形成的:EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric:actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、αMHC基因.10μmol/L5-aza处理组心肌细胞分化率较高.结论 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关.     

维生素C提高体外培养的去分化脂肪细胞心肌分化效率

目的:采用维生素C处理体外培养的去分化脂肪(dedifferentiated fat,DFAT)细胞,以期进一步提高DFAT细胞的心肌分化效率。方法:用天花板贴壁培养法使大鼠成熟脂肪细胞去分化为DFAT细胞,并体外培养增殖至第3代,然后在培养基中添加维生素C或(和)乳鼠心脏细胞裂解液诱导DFAT细胞心肌分化。3周后,用倒置相差显微镜观察DFAT细胞的形态变化,用real-time PCR、免疫荧光和Western blot检测DFAT细胞的心肌特异性标志物c Tn T、GATA-4及NKx2.5 mRNA和蛋白的表达。结果:大鼠脂肪细胞经天花板贴壁培养后形态转变为成纤维细胞样的DFAT细胞。DFAT细胞在普通培养条件下可自发表达少量心肌特异性标志物。经乳鼠心脏细胞裂解液诱导后,DFAT细胞体积增大、变长,可见肌管样结构,c Tn T、GATA-4及NKx2.5 mRNA和蛋白的表达水平较普通培养的DFAT细胞显著升高。在维生素C的作用下,DFAT细胞c Tn T、GATA-4及NKx2.5的表达水平进一步升高。未观察到自发性搏动细胞。结论:维生素C可促进DFAT细胞分化为心肌样细胞。     

昆明小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化

目的饲养层制作及复苏培养昆明小鼠胚胎干细胞,探索体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。方法饲养层制作,复苏及体外培养胚胎干细胞,采用一步法消化贴壁胚胎干细胞,悬浮培养5d,形成拟胚体(EB),待EB贴壁后,加入淫羊藿苷(Icraiin,ICA)诱导液对其诱导并每天观察,免疫荧光检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(cTnT)和心室肌球蛋白轻链(MLC-2v)的表达。结果胚胎干细胞悬浮聚集5d,形成类似球状的拟胚体,将拟胚体贴壁诱导8d,发现拟胚体中出现跳动,诱导后10d拟胚体跳动率达65%,显著高于空白对照组和阴性对照组,一个分化拟胚体中一般出现1-3个跳动点,节律约为50-80times/min,在诱导10d时跳动的合胞体,免疫荧光表明cTnT和MLC-2v表达为阳性。结论胚胎干细胞经悬浮聚集培养5d后经10-7mol/L淫羊藿苷诱导,得到了可以跳动的心肌细胞团。     

抗坏血酸体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的:探讨抗坏血酸作为诱导剂对小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为心肌细胞的影响,建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的实验方法。方法:采用直接悬浮培养法使mESC形成拟胚体(EBs),用含不同浓度抗坏血酸的分化培养基对其进行诱导分化,摸索最佳的诱导分化条件。结果:抗坏血酸诱导mESC分化为心肌细胞的最佳浓度为0.1mg/ml,约为70%的EBs出现跳动的心肌合胞体,显著高于不添加任何诱导剂的对照组。抗坏血酸诱导产生的心肌细胞表达多种心肌蛋白,具有心肌细胞的结构特征。结论:抗坏血酸能够促进mESC向心肌细胞分化,应用抗坏血酸体外诱导mESC向心肌细胞分化是一种较为理想的体外诱导方法。     

不同年龄大鼠骨髓源性心肌干细胞生物学特性的比较

目的 研究不同年龄大鼠骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)形态和衰老相关指标的差异,探讨年龄因素对MCSCs增殖、存活和向心肌细胞分化的影响. 方法 利用单细胞克隆培养技术从幼年、成年和老年雄性SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,透射电镜下观察细胞超微结构改变.SA-β-半乳糖苷酶染色和活性氧(ROS)染色检测细胞衰老变化,流式细胞术分析细胞周期分布.Annexin V/PI双标流式细胞术和Hochest33342染色检测细胞存活和凋亡.用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导不同年龄组MCSCs向心肌细胞分化,通过RT-PCR检测诱导后心肌早期转录因子和心肌特异基因的表达,并通过免疫细胞化学染色检测各年龄组细胞经(BMP-2)诱导后细胞内心肌特异性肌钙蛋T(cTnT)表达的变化. 结果 老年组MCSCs核质比减小,胞质内可见髓样小体.随着年龄增长,处于增殖期的MCSCs比例下降,β-半乳糖苷酶和ROS阳性细胞数目增多.老年组存活细胞比例较幼年组降低.用BMP-2诱导后4周,幼年组细胞的Nkx2.5、GATA-4和cTnT、Cx-43 mRNA表达明显,成年组和老年组细胞表达低于幼年组,差异有显著性意义.免疫细胞化学染色显示,BMP-2诱导后幼年组细胞cTnT表达明显,老年组细胞表达较弱. 结论 随着年龄增长MCSCs发生衰老变化,其增殖、存活和向心肌细胞分化能力逐渐下降.     

二甲基亚砜诱导胚胎干细胞分化伴随凋亡发生

目的：标准化二甲基亚砜（DMSO）诱导胚胎干细胞（ESC）向心肌细胞分化的方法,及DMSO是否同时诱导细胞凋亡。方法：MTT法确定DMSO的应用剂量,不同条件培养基对ESC进行诱导分化,并在形态学、蛋白质及基因水平鉴定ESC源心肌细胞。利用形态学、流式细胞仪等对细胞凋亡进行观测。结果;DMSO的最佳应用浓度为1％,拟胚体经诱导后跳动率为96．7％。该心肌细胞表达多种心肌蛋白,且肌小节结构发育成熟。DMSO的促分化效应可能与心肌转录因子GATA-4的表达有关,1％DMSO可诱导ESC部分产生凋亡,且具有时间和剂量依赖性。结论：1％DMSO不但能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞,且以时间依赖的方式诱导ES-D3细胞部分凋亡。