重组人骨形态发生蛋白-2质粒转染诱导人脐血间充质干细胞软骨分化研究

目的探究从人脐血中提取间充质干细胞，重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2转染干细胞并诱导其成软骨化的可能性。 方法采用密度梯度离心方法获取脐带血中细胞，依据贴壁时间不同获得间充质干细胞，流式细胞仪检测表面抗原表达鉴定细胞；然后把重组有pIRES2-EGFP-hBMP-2的质粒导入间充质干细胞，观察EGFP的表达；ELISA方法检测在不同时间收集的培养基上清中hBMP-2蛋白含量，采用免疫荧光和RT-PCR方法检测目的蛋白和基因表达。转染成功后继续培养细胞2 w，免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达和RT-PCR检测软骨特异性标志物软骨连接蛋白（CRLT1）的表达。 结果两种方法可以获取人脐血间充质干细胞，流式细胞术鉴定发现CD90、CD105、CD146高表达，CD34、CD45、Anti-HLA-DR不表达。非脂质载体包裹重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可成功导入脐血间充质干细胞，转染率为（27.7±7.6）%。ELISA检测实验组和对照组hBMP-2的表达结果有统计学差异（t=3.355，P<0.01）。RT-PCR结果表明hBMP-2基因稳定转录，免疫荧光标记hBMP-2蛋白呈红色荧光。Ⅱ型胶原免疫组化染色示部分细胞被染成棕黄色，RT-PCR结果表明加入转染后的干细胞组CRLT1的表达量比未转染的干细胞组高（t=59.700，P<0.05）。 结论重组hBMP-2基因可以成功转染人脐血间充质干细胞并在胞内稳定表达，且有hBMP-2分泌，并可促进其表达Ⅱ型胶原蛋白及软骨连接蛋白，可向软骨细胞化诱导。     

hIGF-1基因改良修饰人脐血间充质细胞的研究

目的研究hIGF-1基因改良修饰人脐血间充质干细胞的方法,为关节软骨组织工程修复提供良好的种子细胞。 方法综合应用密度梯度离心法和细胞贴壁法分离培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪进行细胞鉴定。通过X-tremen HP介导将含hIGF-1基因全长的真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-I转染人脐血间充质干细胞,倒置荧光显微镜检测转染后荧光蛋白的表达,计算转染效率,ELISA检测转染后细胞上清液中hIGF-1的含量变化,免疫荧光与RT-PCR检测hIGF-1在细胞中的表达,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达。 结果人脐血间充质干细胞表面表达CD105（99.93%）、CD90（99.85%）、CD146（73.63%）,不表达Anti-HLA-DR（1.38%）、CD45（0.13%）、CD34（0.11%）。hIGF-1基因可在X-tremen HP介导下转染人脐血间充质干细胞,48 h转染效率为（29±8）%。转染后48 h分泌的hIGF-1最多,为（34.89±0.38）ng/ml,且与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）。转染后细胞可检测到hIGF-1 mRNA、蛋白以及Ⅱ型胶原表达。 结论hIGF-1基因可通过X-tremen HP介导改良修饰人脐血间充质干细胞,促进hIGF-1和Ⅱ型胶原的表达与分泌。     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSc),检测外源基因的表达.方法常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达.结果原位杂交和免疫组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现.结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达.     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的：采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7（hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSc ),检测外源基因的表达。方法：常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。结果：原位杂交和组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现。结论：采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达。     

基因转染脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究

目的 观察人转化生长因子(hTGF)β2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞的定向分化能力,探讨脂肪间充质干细胞作为种子细胞和在基因增强的软骨组织工程中应用的可行性.方法 取3周龄Lewis大鼠的脂肪组织,消化法获得脂肪间充质干细胞,pcDNA 3.1(+)/hTGFD2通过脂质体介导转染脂肪间充质干细胞,用免疫化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测筛选的阳性克隆细胞中hTGFB2基因与软骨特异性蛋白-Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况;然后将基因转染的脂肪间充质干细胞与PLGA支架体外构建细胞-载体复合物,再将其植入裸鼠体内,12周后观察基因增强的组织工程软骨的形成情况.结果 从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪问充质干细胞,能大量稳定增殖传代.hTGFB2基因在脂肪间充质干细胞内能瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成;细胞.载体复合物在裸鼠体内经12周的培养,可以形成形态、结构接近正常软骨的组织工程软骨.结论 PODNA 3.1(+)/hTGFl32成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化,脂肪间充质干细胞可作为基因增强的软骨组织工程较理想的种子细胞.     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

转化生长因子-β1基因修饰对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞经转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)基因修饰后增殖能力和向软骨细胞分化能力的变化。方法利用脂质体将pcDNA3-TGF-β1基因导入骨髓间充质干细胞,通过大体形态观察、CCK-8测定转染前后骨髓间充质干细胞的增殖代谢能力,同时RT-PCR和Westernblot法检测软骨特异性细胞外基质蛋白Ⅱ型胶原的表达。结果基因修饰后骨髓间充质干细胞倍增能力明显增强,并且Ⅱ型胶原蛋白表达增加。结论经TGF-β1基因修饰的MSCs向软骨细胞分化能力增强,是优秀的软骨组织工程种子细胞。     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

人生长分化因子5重组质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞体外成软骨观察

目的观察人生长分化因子5(h GDF5)重组质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨的能力,为其用于体内修复软骨损伤提供理论基础。方法在特殊诱导液中体外单层培养h GDF5重组基因质粒转染的BMSCs,离心成细胞球观察。于14、28 d取组织块进行HE及甲苯胺蓝染色。于28 d取组织块进行软骨胶原免疫组化及免疫荧光染色。未转染h GDF5的BMSCs作对照亦同样处理和观察。结果 h GDF5重组质粒转染BMSCs体外培养可形成具有类似透明软骨组织学和生物化学性质的组织块,转染细胞合成分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(PG)。结论 h GDF5重组质粒转染BMSCs在体外可形成软骨组织,有望用于关节软骨损伤的基因治疗。     

可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达

目的构建可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体,并研究hBMP-2在人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可诱导性表达。方法以pcDNA-hBMP-2为模板,通过PCR反应获取hBMP-2,运用GATEWAY技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-反向反式激活因子(reverse transactivator,rtTA),通过PCR鉴定重组慢病毒载体构建。将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT细胞,包装成能表达hBMP-2的可控性慢病毒,并测定病毒滴度。用病毒转染HUMSCs,使用强力霉素进行诱导,分别在相同诱导时间(48h)不同诱导浓度(0、10、100ng/mL,1、10、100μg/mL)及不同诱导时间(12、24、48、72h)相同诱导浓度(10μg/mL)两种情况下用ELISA法测定hBMP-2的表达情况。对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。结果成功构建了携带hBMP-2的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA,并获得相应的病毒,病毒滴度分别为3.5×108TU/mL和9.5×107TU/mL;病毒转染HUMSCs后,HUMSCs可通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2。在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/mL时诱导表达最强;而在相同诱导浓度下,hBMP-2的表达在诱导48h达峰值。HUMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。结论通过GATEWAY技术可以建立携带hBMP-2目的基因的可控性慢病毒载体,为进一步研究hBMP-2诱导HUMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路。     

人脐血源和骨髓源间充质干细胞神经前体细胞分化的研究

目的 对比研究人脐血和骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外的分离、培养和生物学特性,并观察其分化潜能和形态学变化,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法分别分离纯化成人骨髓和脐血源MSCs,体外培养和连续传代,并在含有2%B27的Neurobasal培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子,将获得的MSCs向神经干细胞定向诱导,利用倒置显微镜连续观察细胞培养、传代和向神经细胞表型转化过程的形态学变化;采用免疫组化和荧光免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定.结果 原代分离的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在接种后48 h贴壁,7 d细胞呈长梭形,有一定的方向性,并达到90%融合;而脐血间充质干细胞(UMSCs)48 h后贴壁,似乎贴的不牢,持续14d才能形成小丛、小簇、小集落,21 d排列才有一定的方向性.培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经前体细胞样表型,免疫组化和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志β微管蛋白(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质相关蛋白(GFAP).结论 人脐血和骨髓中含MSCs,且具备其基本恃征,体外培养UMSCs生长速度比BMSCs缓慢10 d～15 d左右,传代以后的各组细胞生长速度与形态无明显差异.骨髓和脐血来源的MSCs在体外可定向诱导分化为神经细胞.     

小鼠骨髓间充质干细胞Osterix基因特异siRNA的设计和沉默作用

目的 探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制骨髓间充质干细胞内Osterix基因表达,筛选高效特异性siRNA。方法 根据siRNA设计原则,针对Osterix基因序列特征设计Osterix特异siRNA( 1-3 ),转染骨髓间充质干细胞,用QPCR和Western blot方法检测siRNA对Oslerix基因的抑制效果。结果 Osterix siRNA-2可有效抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达。随siRNA-2终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L及200 nmol/L,抑制效率逐渐增强（P < 0. 05);siHNA-2以终浓度200 rnnol/L转染后48 h抑制效果最强,72 h逐渐减弱,但仍明显抑制（P< 0. 05 )。结论 应用RNA干扰技术可抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达,其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性。     

人骨形成蛋白7基因重组35型腺病毒载体的构建与鉴定

目的探讨构建携带人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因的重组35型腺病毒(serotype35adenovirus,Ad5F35)载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法以pcDNA1.1/Amp-hBMP7质粒为模板扩增骨形成蛋白(BMP-7)基因(1.3kb),将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP7共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7。同样的方法构建rAd5/F35-EGFP。在体外用不同感染复数(M.O.I)值的rAd5/F35-hBMP7和rAd5/F35-GFP分别转染兔MSCs,并留置空白对照。采用流式细胞仪、RT-PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7质粒构建正确。转染兔MSCs的最高效率可达99%,hBMP-7基因存在于转染后的MSCs中并表达相应的mRNA。结论本实验成功构建了含hBMP-7基因的重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7载体,在体外能高效转染兔MSCs。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

负载人骨形态发生蛋白-7基因的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰对兔脂肪干细胞(ADSCs)成骨能力的影响. 方法 原代培养兔脂肪干细胞,免疫组织化学方法检测细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106的表达,对细胞进行鉴定;阳离子脂质体介导hBMP-7基因转染ADSCs,绿色荧光蛋白表达观察转染效率、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因hBMP-7的表达;ALP定量测定,Western blot检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,以评价转基因ADSCs向成骨细胞分化的情况. 结果 从兔脂肪组织中分离出来的ADSCs CD44、CD49d表达呈阳性,CD106表达呈阴性.RT-PCR检测筛选后的ADSCs稳定表达hBMP-7.转染后7、10、14 d ALP定量测定转染组明显高于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);成骨标志物Ⅰ型胶原、骨钙素的表达转染组明显高于未转染组.结论 从脂肪组织中分离出的ADSCs是一种较好的组织工程种子细胞.hBMP-7重组质粒转染ADSCs后表达目的蛋白,并诱导ADSCs向成骨细胞分化.     

LMP-1基因慢病毒重组体对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖影响及其表达

目的：探讨LMP-1重组慢病毒载体体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的方法,并检测LMp-1基因对BMSC增殖能力的影响及表达。方法：选取清洁级4周龄SD大鼠6只（雌雄不限）,无菌条件下提取骨髓间充质干细胞并培养至第3代,设立空白对照组（未经特殊处理,只有第3代骨髓间充质干细胞）、慢病毒载体转染组（在未经特殊处理的第3代骨髓间充质干细胞中加入PGC-FU-GFP及转染试剂Polybrene）和重组基因转染组（在未经特殊处理的第3代骨髓间充质干细胞中加入PGC-FU-LMP．1-GFP及转染试剂Polybrene）进行转染。转染48h后,通过免疫荧光显微镜观察荧光表达,流式细胞仪检测慢病毒的转染效率,采用MTY法评价慢病毒转染对BMSC增殖的影响;WesternBlot检测转染后基因的表达情况。结果：①成功培养出第3代SD大鼠BMSC,以100的感染复数（MOI）转染,48h后免疫荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率达67％;②不同时间点慢病毒载体转染组和重组基因转染组,与空白对照组细胞增殖比较差异无统计学意义;③WestemBlot检测示重组基因转染组72kDa处有条特征带,其大小与LMP－l融合蛋白（～50kDa＋28kDa=78kDa）基本吻合。结论：经LMp-1基因慢病毒重组体转染大鼠骨髓间充质干细胞对其增殖活力没有影响并可有效表达LMP－1。     

ANG-1基因重组腺病毒载体的构建及其转染骨髓问充质干细胞的实验研究

目的构建携带大鼠血管生成素．1（angiopoietin-1,ANG．1）基因的重组腺病毒载体,并检测其转染对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）活力的影响。方法RT-PCR法获取大鼠ANG-1基因并亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,经测序无误后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组。重组质粒pAdEasy-1-ANG-1经鉴定后转染293细胞进行病毒包装扩增。体外转染BMSCs,检测转染后BMSCs中ANG-1的表达。MTT法评估常氧及缺氧环境下ANG-1对BMSCs的影响。结果重组腺病毒载体pAdEasy-1-ANG-1经测序及酶切鉴定正确;BMSCs经转染ANG-1基因后表达ANG-1。MTT法检测提示常氧及缺氧条件下转染前后BMSCs活性的差异均无统计学意义（缺氧组与缺氧下转染组相比,P〉0-05;常氧组与常氧下转染组相比,P〉0-05）。结论成功构建大鼠ANG-1基因重组腺病毒载体,且其转染在体外不影响BMSCs的活性。