Tudor-SN蛋白TSN结构域亚结构片段重组质粒的构建与表达

目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建

目的 探讨构建携带hIG-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性.方法 从pcDNA 3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ.鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ).再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度.将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的 条带,Western blot得到7.6kDa大小的同的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达.结论 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体.     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

Construction and identification of eukaryotic expression plasmids containing SLPI gene

目的 构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒.方法 以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒.将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体peDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达.结果 核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白.结论 成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒.     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂（DSB）修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞（HLF）总RNA，逆转录酶-多聚酶链式反应（RT-PCR）扩增hKu70基因cDNA保守序列，经与pGEM-T载体连接，筛选，克隆，抽提质粒和双酶切后，将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中，筛选，克隆，抽提质粒，从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K。结果 经RT-PCR获得467bp含限制性内切酶位点的DNA片段，T载体克隆后经双酶切，测序，确定该片段为hKu70基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，并双酶切，测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为建立该基因低表达细胞株，DNA双链断裂修复缺陷和有关毒理学研究提供工具。     

Antimycotic 2-alkyldithio, 2-aralkyldithio, 2-aryldithiobenzamides

Some 2-alkyldithio, 2-aralkyldithio, 2-aryldithio benzoic acids, their methyl esters and N-monosubstituted amides were prepared and tested in vitro against Candida albicans and Trichophyton mentagrophytes. Some N-monosubstituted amides displayed activities similar to those of clotrimazole and pyrrolnitrin. Against Candida albicans, N-monosubstituted amides exhibited a generally higher activity than the corresponding N-monosubstituted amides of 2,2'-dicarboxydiphenyldisulfide.     

2'-Deoxy-2'-methylenecytidine and 2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine 5'-diphosphates: potent mechanism-based inhibitors of ribonucleotide reductase

It has been found that 2'-deoxy-2'-methyleneuridine (MdUrd), 2'-deoxy-2'-methylenecytidine (MdCyd), and 2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine (dFdCyd) 5'-diphosphates (MdUDP (1) MdCDP (2) and dFdCDP (3), respectively) function as irreversible inactivators of the Escherichia coli ribonucleoside diphosphate reductase (RDPR). 2 is a much more potent inhibitor than its uridine analogue 1. It is proposed that 2 undergoes abstraction of H3' to give an allylic radical that captures a hydrogen atom and decomposes to an active alkylating furanone species. RDPR also accepts 3 as an alternative substrate analogue and presumably executes an initial abstraction of H3' to initiate formation of a suicide species. Both 2 and 3 give inactivation results that differ from those of previously studied inhibitors. The potent anticancer activities of MdCyd and dFdCyd indicate a significant chemotherapeutic potential. The analogous RDPR of mammalian cells should be regarded as a likely target and/or activating enzyme for these novel mechanism-based inactivators.     

2-苯基-1-丁醇与2-二甲氨基-2-苯基丁腈的合成

目的为马来酸曲美布汀的重要中间体2-二甲氨基-2-苯基-1-丁醇的合成奠定基础。方法苯乙腈与溴乙烷进行烃化反应得2-苯基-1-丁腈,所得产物经水解得2-苯基-1-丁酸,然后通过硼氢化钠-碘体系还原得2-苯基-1-丁醇;苯乙腈与N-溴代丁二酰亚胺进行卤代反应得溴代苯乙腈,所得产物与二甲胺进行烃化反应得2-二甲氨基苯乙腈,然后与溴乙烷进行烃化反应得2-二甲氨基-2-苯基丁腈。结果合成了2-苯基-1-丁醇和2-二甲氨基-2-苯基丁腈,总收率为分别为51%和59.4%。目标产物的结构经核磁共振氢谱、质谱确证。结论本合成方法原料易得,操作简单,收率较高,适合于工业化生产。