害虫抗药性分子检测技术发展现状

记述8种当前用于害虫抗药性检测的分子生物学方法:专一性等位基因PCR扩增;PCR-单链构象多态性;固相微测序反应;限制性片段长度多态性;PCR-寡核苷酸探针斑点杂交;随机扩增多态性DNA;Northern斑点杂交;固定化人工膜-高效液相色谱。评述各种检测技术基本原理、在害虫抗性检测中的优缺点及应用范围。     

一种绘制限制性酶切位点的方法——固相法

本文介绍利用固相法来进行限制性酶切位点的绘制,按照作者的方法,可以避免在得到单一末端标记DNA过程中的复杂工作,并且不需要使用放射性物质。作者在PCR反应中使用一个末端带有生物素标记的引物和一个不带有标记的引物来扩增所需的DNA片段。这些引物可存在于DNA片断中或载体侧翼的已知顺序中。得到的线状DNA将在一端带有生物素标记。然后线状DNA被连接在带有链霉亲合素的磁珠上,通过洗脱去掉杂质,再选择合适的限制性酶直接对结合在磁珠上的DNA进行部分酶切。上述方法与已建立的固相测序法相似。除了标上     

原位PCR技术及其应用

多聚酶链反应(PER)已广泛应用于扩增特定的DNA序列,从而能对许多疾病进行分子水平的分析。PCR虽然能扩增包括经福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA,但扩增的DNA产物不能在组织细胞中定位,因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系,这是该技术的一个局限性。原位杂交     

应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因

目的 筛选干扰素β（IFN-β）启动子DNA结合蛋白的基因，探讨IFN-β基因调节的分子生物学机制。方法 应用噬菌体展示技术，以IFN-β启动子DNA的聚合酶链反应（PCR）产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选过程，噬斑PCR扩增后，对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果 噬菌体经富集后，随机挑选52个克隆，序列测定后经过同源性搜索，确定与IFN-β启动子具有结合作用的肝细胞蛋白有6种，包括谷胱甘肽S-转移酶（GST），淀粉酶突变体蛋白，锌指蛋白等与细胞发育和代谢有关的蛋白。结论 IFN-β启动子DNA与肝细胞中多种蛋白类型结合，为研究IFN-β基因在肝细胞中的表达调控奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白

目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。     

应用ELISA法直接定量测定PCR产物

本文介绍了一种不经电泳和/或杂交便可直接定量测定PCR产物的PCR/ELISA法,其原理和检测步骤如下: 用于PCR的一对引物的两个5'-端分别用生物素和FITC(作抗原)标记,前者用于固相化,后者用于定量改定。靶DNA序列经PCR扩增后的产物为两端分别含有生物素和FITC的双股DNA片段。     

基因芯片技术在医学研究中的应用

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上 ,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于基因表达谱的分析、突变检测 ,克隆选择和文库筛选等研究工作 ,同时在人类疾病的检测 ,预防等方面也具有广阔的应用价值 ,在未来的生命科学领域中必将发挥重要作     

应用PCR法从血凝块和干血样品中检测基因突变

为适应流行病学调查,探讨从血凝块或干血样中提取DNA样品,应用PCR扩增DNA片段的方法技术极其必要。本文详细叙述了用人血凝块和干血样品提取DNA模板,通过固定、煮沸等步骤,可以应用多聚酶链反应体系得到目的基因的扩增片段,经电泳分离可以检测载脂蛋白的基因变异。本方法简便、省时、快速。     

基因芯片技术

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于基因表达谱的分析、突变检测、多态性分析、基因测序和基因组文库作图等研究工作,同时在人类疾病的检测、预防等方面也具有广阔的潜在应用价值,在未来的生命科学领域中必将发挥重要的作用。     

长链PCR扩增低密度脂蛋白受体基因大片段的研究

为探讨扩增大片段ＤＮＡ的方法，应用长链聚合酶链反应（长链ＰＣＲ）法从外周血细胞基因组中扩增获得低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体基因６个片段，它们的长度分别为：５．５、５．０、７．０、６．８、３．５和８．３ｋｂ。各扩增产物都经Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ双脱氧固相测序法测定证实。讨论了长链ＰＣＲ技术中影响效率和特异性的关键参数，以及此项新技术在ＬＤＬ受体基因突变检测和家族性高胆固醇血症等基因诊断中的应用前景。为基因大片段的扩增提供了有效方法。     

全基因组扩增技术最新进展及其法医学应用现状

微量模板DNA的检测，是很多领域迫切需要解决的一个难题。因为其DNA量不足，用现有的技术手段常无法检测成功。全基因组扩增技术可对非常微量的DNA进行均衡的扩增而获得大量的DNA，故被认为是目前解决这一难题的一种基本方法，已被广泛用于法医学、单细胞遗传病的诊断及疾病基因的分析等领域研究，并取得了良好的效果。本文对这一技术的最新研究进展及其在法医学方面的应用现状做一综述。     

多重置换扩增在植入前遗传学诊断中的应用及展望

多重置换扩增是一种新兴的全基因组扩增技术,能对单个细胞进行全基因扩增,产生大量的优质DNA,具有高扩增效率和高保真性等特点.多重置换扩增联合常规PCR已被成功用于植入前遗传学诊断,进一步扩展了后者的应用范围.     

肿瘤中扩增基因的筛选策略

肿瘤基因组中常有大片段的 DNA扩增 ,鉴定这些扩增片段中的基因是寻找与特定肿瘤发生发展密切相关癌基因的策略之一。通过微阵列比较基因组杂交和限制性内切酶标记位点基因组扫描分析等 ,可以发现肿瘤中扩增的 DNA片段 ,其中所包含的扩增的基因及其 m RNA和蛋白水平的变化可采用定量 PCR和组织芯片免疫组织化学等方法加以检测。筛选出与特定肿瘤相关的扩增基因后 ,使用细胞转染、RNA干扰、c DNA芯片或逆转录多重连接依赖的探针扩增等方法进一步研究将有助于明确目的基因在特定肿瘤发生发展中所起的作用。     

酶促放大基因组DNA中特定序列的直接克隆与序列分析

为了解遗传病或复杂的基因多态现象的分子基础,需要在个体水平详细分析某些位点DNA序列的变化。目前分析每一个等位基因突变个体要经过建立基因文库、筛选、绘制物理图谱、次级克隆,DNA序列等一系列繁杂的工作。本文作者应用体外聚合酶促DNA扩增技术,对基因组DNA中特定     

扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA构建方法及其对产前诊断21-三体综合征中价值研究

目的建立扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA(cff DNA)的方法,并对该方法在21-三体综合征产前诊断中的应用价值进行分析,以期提高21-三体综合征产前检出率,提高优生率。方法选择2014年10月~2017年4月本院行产前优生优育检查的60例高危21-三体综合征胎儿孕妇作为研究对象,取所有孕妇的空腹肘静脉血进行PCR扩增血浆中游离胎儿DNA的方法构建研究,提取血浆中胎儿游离DNA,分别在76~83℃温度条件下对不同长度的DNA模板进行扩增,分别在76.6~86.6℃温度条件下对连接DNA进行整体扩增,分别在80~86.9℃温度条件下对整体扩增的影响,在81.4~86.9℃温度对整体扩增效率的影响。总结不同温度对cff DNA监测时PCR扩增的效果影响,根据上述结果构建扩增片段长度多态性(AFLP)方法检测cff DNA的方法。对60例孕妇cff DNA按照传统和新构建的AFLP方法对不同的模板进行扩增,比较两种ALFP对不同长度目的产物片段的整体效率并比较。分别进行60例孕妇中49例行羊膜腔穿刺取羊水行胎儿DNA检测,11例孕妇流产,孕妇流产过程中取羊水进行DNA检测。对60例孕妇cff DNA按照传统和新构建的AFLP方法分别进行21-三体综合征检测。以羊膜腔穿刺DNA检测和流产胎儿组织DNA检测结果为金标准,计算传统和新构建AFLP方法检测的cff DNA中21-单体综合征的敏感度、特异度、准确度。结果 79.9~82.4℃温度范围可有效提高300bp片段的cff DNA小片段扩增,而300bp片段扩增效果差,这一温度范围可有效分离母体DNA与胎儿游离DNA。80.4℃-82.4℃可有效区分链接后cff DNA模板扩增图像,82.6℃-84.2℃变性温度可有效区分片段长度500bp目标片段,选择80-83℃扩增温度条件是适合cff DNA扩增效果的变性温度。新构建AFLP扩增法可有效提升产前诊断21-三体综合征的诊断特异度度和准确度。结论在一定范围内降低PCR反应的变性温度能够引起cf DNA连接接头后整体扩增中大片段模板不能有效扩增,同时不影响小片段模板的扩增。可达到和有效区分母源性和胎源性DNA的效果,提升诊断的准确率,提升产前遗传优生指导正确性。     

物理吸附于聚苯乙烯乳胶颗粒上的McAb的特性鉴定

将McAb固定在固相支持物上,已广泛用于诸如ELISA、SPIA、RIA和乳胶凝集试验等诊断系统。在免疫学测定中,最常用的固相支持物为聚苯乙烯,固相化的方法主要是物理性吸附。然而,将McAb物理吸附在固相支持物上,由于附着在固相支持物上     

应用酚提取法纯化孕妇血浆及血清中胎儿游离DNA

目的：应用酚提取法以提高纯化孕妇血中胎儿DNA的浓度，并应用套式PCR技术确定男性胎儿SRY基因的存在。方法：孕妇血浆和血清5-10ml采自孕龄为7-38周孕1产0的孕妇26名。其中孕男性单胎正常孕妇18名，孕女胎正常孕妇8名。加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇抽提，并经冰浴离心，所得DNA应用套式PCR技术确定男性胎儿SRY基因的存在。结果：血浆标本在第1次PCR扩增后有12名出现351bp的阳性一扩增带。其余6名在第2次扩增后出现254bp的阳性扩增带。第1次扩增确定性别的准确率是72.2%，第2次扩增是100%。血肖标本在第1次扩增后有9名出现351bp阳性扩增带，第2次有16名出现254bp阳性扩增带。第1次扩增确定性别的准确率为50%，两次准确率共为88.9%。同时对2例X-连锁遗传病患者（假性肥大性肌营养不良症和无汗性外胚层发育不良症的患者）进行了产前性别判断。结论：单纯应用酚提取的方法也可以纯化孕妇血浆及血清中胎儿游离DNA的浓度，可以应用较大量的孕妇血浆及血清进行DNA提取，以获得较高胎儿DNA的浓度。加用套式PCR使确定胎儿性别的准确率得到提高。提示可用此方法对有X-连锁遗传病家族史的患者进行产前性别判断 。     

两种全基因组扩增方法用于微量检材STR基因座分型比较

目的 应用多重置换扩增(MDA)技术和改进型扩增前引物延伸（IPEP）技术对法医学微量DNA进行全基因组扩增，比较两种方法的STR分型效果及法医学应用价值。 方法 用MDA、IPEP方法分别对不同模板量DNA进行扩增，扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR® Identifiler®试剂盒检测基因型。 结果 MDA方法可对模板DNA增加103～106倍，IPEP方法可增加25～310倍。为获得完整准确的分型结果，MDA最低需1ng基因组DNA，IPEP最低需0.05ng基因组DNA。当基因组DNA为0.01ng～0.1ng时，IPEP产物、MDA产物的平均基因座检出数均高于未经全基因组扩增的DNA，其中IPEP产物的平均基因座检出数高于MDA产物。 结论 MDA方法、IPEP方法均可提高微量检材的STR分型效果。MDA方法的产量高于IPEP方法；IPEP方法的灵敏度高于MDA方法，且对微量DNA的STR分型效果优于MDA方法，因此更适于法医学痕量DNA检测。     

直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫。结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。     

信号放大系统的原理及在病毒核酸检测中的应用

在病毒性疾病诊断中 ,核酸检测是最直接、最确切的手段。对难于分离培养 ,或不易用免疫学方法检测特异性抗原、抗体的病毒 ,更为重要。但单纯核酸探针的敏感性不高 ,为提高检测敏感性 ,有两种主要途径 :1模板扩增技术 ,它通过扩增靶序列来提高敏感性 ;2信号放大系统 ,它通过放大杂交后信号强度来提高敏感性。它反应迅速 ,简便易行 ,没有模板扩增的干扰因素 ,近年来在核酸检测越来越受到重视。常用的信号放大系统有分支 DNA探针 ,3DNA树状体 ,DNA标记脂质体等 ,本文拟就常用信号放大系统的原理及其在病毒核酸检测中的应用作一综述