人结肠癌细胞系中癌相关基因的表达及表型遗传修饰的影响

目的 观察DNA甲基化和组蛋白乙酰化对人结肠癌细胞系癌相关基因的表达和细胞周期的影响。方法 培养2种结肠癌细胞系SW1116和Colo-320，分别以去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-dC)和(或)组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂trichcxstatin A(TSA)及丁酸盐干预细胞。提取细胞总RNA，以RT-PCR和定量RT-PCR法研究抑癌基因p16^INK4A、APC、p2^WAF1、p53和p73以及癌基因c-myc和c-Ki-ras、凋亡抑制基因survivin mRNA表达水平；并运用流式细胞术检测细胞周期变化。结果正常情况下，SW1116和Colo-320细胞系中均有较弱的p16^INK4A和APC表达；两种结肠癌细胞系p21^WAF1表达缺如，而p53、p73和c-myc、c-Ki-ras以及survivin均表达。以5-aza-dC干预后，p16^INK4A和APC表达增强，且不同的结肠癌细胞系表达增强最明显时5-aza-dC干预的时间与浓度不同。相反p21^WAF1仍无明显表达。值得注意的是这两个细胞系经TSA或丁酸盐处理后，p21^WAF1转录水平显著上调。p53、p73、c-myc、c-Ki-ras和survivin基因在干预前后表达无明显变化。另外，5-aza-dC并不能改变细胞周期，而TSA或丁酸盐使细胞阻滞于G1期。结论 两种人结肠癌细胞系中，p16^INK4A和APC基因的表达均受甲基化调节；p21^WAF1基因表达主要受乙酰化调节，乙酰化使细胞周期停滞于G1期；而p53、p73、c-myc、c-Ki-ras和survivin基因的表达不受甲基化或乙酰化的调节。     

Islet-1诱导成纤维细胞系C3H10T1/2向心肌细胞分化过程中组蛋白乙酰化与DNA甲基化在GATA4启动子区的关系

目的研究在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的心肌早期发育相关基因GATA4启动子区域组蛋白乙酰化与DNA甲基化的相互作用关系。方法构建过表达Islet-1细胞模型,在GATA4基因表达过程中,用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测其启动子区组蛋白H3K9乙酰化的时序性变化;甲基化特异性PCR技术(MSP)检测其启动子区Cp G岛甲基化的时序性变化,明确两者之间相互作用的关系。结果随着Islet-1诱导C3H10T1/2向心肌细胞特异分化的时间延长,GATA4基因的表达增高(P0.05),其启动子区第2个Cp G位点组蛋白H3K9乙酰化的水平升高(P0.05),DNA甲基化水平降低(P0.05)。结论 Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞特异分化过程中,组蛋白乙酰化和DNA甲基化在调控心肌特异早期转录因子GATA4表达过程中存在相互拮抗作用,从而促其表达呈时序性变化。     

食管鳞状细胞癌中p16基因甲基化及其表达

目的：探讨食管鳞状细胞癌p16／INK4基因启动子区高甲基化和p16、cyclinD1蛋白表达的意义。方法：用甲基化特异性PCR（MSP）法检测p16／INK4基因启动子区的高甲基化，用免疫组织化学方法检测p16、cyclind1蛋白的表达。结果：30例食管鳞状细胞癌中7例p16免疫组织化学阳性，15例cyclinD1阳性，组织学和统计学分析显示p16与cyclinD1的表达呈负相关。4例检出p16／INK4基因启动子区高甲基化，但与p16失表达无统计学意义。结论：（1）在食管鳞状细胞癌可检出p16／INK4基因启动子区的高甲基化，而甲基化不是引起p16失表达的主要原因。（2）p16与cyclinD1的表达呈负相关，提示细胞周期调控因子之间可能存在相互影响表达的反馈机制。     

TSA通过组蛋白乙酰化影响TLR2基因表达

目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Trichostatin A,TSA)处理人THP-1细胞,干预组蛋白H3乙酰化水平,探讨组蛋白H3乙酰化对人THP-1细胞中TLR2基因表达水平的影响。方法构建THP-1巨噬细胞模型,分别利用不同浓度TSA处理细胞,Real-time PCR和Western blot方法检测m RNA和蛋白的表达;染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)比较TSA处理前后启动子区H3乙酰化水平。结果TSA以浓度依赖方式上调表达水平。TSA上调组蛋白H3乙酰化水平,使启动子区H3乙酰化水平明显上升。结论 TSA通过组蛋白H3乙酰化影响基因表达,这是乙酰化调控TLR2基因表达的一种可能机制。     

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞脑啡肽酶基因的表达与启动子区甲基化和组蛋白修饰相关

目的研究小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(N2a)细胞中脑啡肽酶(NEP)基因表达的表观调控机制,探讨DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用。方法体外培养N2a细胞,以3μmol/L、5μmol/L DNA甲基化酶抑制5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-dc)及(300、500、700)nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)分别处理N2a细胞48 h和24 h。采用逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot法分别检测NEP的mRNA、蛋白表达;亚硫酸氢盐测序聚合酶链反应(BSP)法检测NEP基因启动子区DNA的甲基化水平;染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测NEP基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平。结果 5-Aza-dc和TSA均能剂量依赖地提高NEP基因的表达(P0.01);5-Aza-dc可诱导NEP基因去甲基化(P0.01);TSA可增高NEP组蛋白H3乙酰化水平(P0.05),但不能明显改变NEP基因DNA的甲基化水平(P0.05)。结论在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中NEP基因的表达受DNA甲基化及组蛋白乙酰化的调控,组蛋白乙酰化水平并不影响DNA甲基化状态。     

HIV-1感染者淋巴细胞活化与第二受体表达的研究

目的：了解HIV－1感染者体内淋巴细胞的活化情况及表达第二受体CCR5、CXCR4的淋巴细胞活化状态，分析这些指标与疾病严重程度的关系，探讨HIV感染的免疫基础。方法：用三色标记法流式细胞术检测24例HIV－1感染者及13例健康对照的抗凝血标本，分析活化标志物HLA－DR及第二受体CCR5、CXCR4的表达等指标。结果：HIV－1感染者CD8^ T淋巴细胞的HLA－DR表达高于健康对照（P＜0．001）；HIV－1感染者表达CCR5、CXCR4的CD8^ T淋巴细胞活化明显高于健康对照（P＜0．001）；表达CCR5CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞与表达CXCR4相比HL－DR表达均明显增高（P＜0．001）；CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞的活化状态与CD4百分率的变化明显关系。结论：HIV－1感染者CD8^ T淋巴细胞及表达不同第二受体的CD8^ T淋巴细胞活化程度明显增高，活化程度与疾病进程相关。     

苯中毒病人TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白化学修饰改变

目的:研究拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)启动子调控因子SP1组蛋白化学修饰在苯中毒病人中的改变。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀技术探讨TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白乙酰化和甲基化水平的变化,RT-PCR法测定Sp1 mRNA的表达水平。结果:与对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4和H3乙酰化水平下降(P0.01),组蛋白H3K9甲基化水平升高(P0.01),组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变。与正常对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1的mRNA表达水平降低(P0.05)。结论:慢性苯中毒TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰水平的改变伴随着mRNA水平的变化。TOPOⅡα启动子调控因子Sp1可能通过组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰改变在苯中毒所致的造血毒性中发挥作用。     

启动子甲基化调控NK-92MI细胞KIR3DL1基因表达

目的:观察NK细胞系NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化模式及去甲基化和组蛋白乙酰化对基因表达的影响,探讨KIR3DL1基因的表达调控机制.方法:采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷和(或)组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂曲古抑菌素A处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化和组蛋白乙酰化,观察启动子区CpG岛甲基化和组蛋白乙酰化与KIR3DL1基因表达的关系.结果:NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区高甲基化,CpG二核苷酸甲基化频率在70%～100%之间;应用终浓度为2.5 μmol/L和5 μmol/L的5-氮胞苷作用72 h可以诱导NK-92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量分别增加66.6%和114.6%;单用终浓度为50 nmol/L的曲古抑菌素A不能诱导NK-92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量增加;此外,曲古抑菌素A和5-氮胞苷联用与单用5-氮胞苷相比也没有协同作用.结论:NK-92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控.     

乳腺癌中印记基因SLC22A18/TSSC5/BWR1A启动子区甲基化及mRNA表达的研究

目的： 研究印记基因SLC22A18启动子区甲基化对乳腺侵润性导管癌组织中的SLC22A18 mRNA表达的影响，探讨其与临床病理特征之间的关系。方法：实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative RT-PCR）方法检测40例乳腺侵润性导管癌及其癌旁组织中SLC22A18 mRNA的表达，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SLC22A18基因启动子区的甲基化状态。检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231后，对SLC22A18基因启动子区DNA甲基化和mRNA表达的影响。结果：SLC22A18在40例乳腺侵润性导管癌中mRNA表达量低于癌旁组织（0.12±0.10 vs 0.69±1.05，P＜0.01）；40例乳腺侵润性导管癌及对应癌旁组织中，SLC22A18启动子区的甲基化发生率分别为75％和37.5%，差异有统计学意义（P＜0.01）；在40例乳腺侵润性导管癌组织中，甲基化组SLC22A18 mRNA表达量低于非甲基化组（0.11±0.08 vs 0.24±0.18，P＜0.01）。5-aza-dc和5-aza-dc/TSA能不同程度逆转乳腺癌细胞株MDA-MB-231中SLC22A18基因的甲基化状态，并上调SLC22A18基因表达。结论：SLC22A18基因甲基化与乳腺癌发生有一定的关联，SLC22A18基因表达下调与其启动子区CpG岛异常甲基化相关。     

原发胃癌中p16和p15基因表达及甲基化异常

为检测胃癌组织中抑癌基因p16,p15及其启动子区甲基化状态和P16、P15蛋白表达情况。选择p16、p15基因及启动子区域，用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）和测序法对100例胃癌患者的癌组织、癌旁正常组织和5例正常组织进行检测，同时用免疫组化法检测了癌组织和正常对照组织的P16和P15的表达。结果发现癌组织p16和p15基因启动子区甲基化率显著高于癌旁正常组织和正常对照；胃癌组织中，71％的病例P16表达阴性，54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化，无突变和纯合缺失检出；11％的病例P15表达阴性，9％的病例具有p15基因启动子区的高甲基化，p15异常与低分化胃癌有关，p15基因内含子1和外显子1内各发现1例DNA序列改变；癌组织中p16和p15基因启动子区甲基化与其蛋白表达密切相关。结果显示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的关键因素之一，并在胃癌的发生发展中发挥重要作用；p15基因启动子区域高甲基化在胃癌中起一定作用。     

Methylation of histone H4 by arginine methyltransferase PRMT1 is essential in vivo for many subsequent histone modifications

PRMT1 is a histone methyltransferase that methylates Arg3 on histone H4. When we used siRNA to knock down PRMT1 in an erythroid cell line, it resulted in nearly complete loss of H4 Arg3 methylation across the chicken beta-globin domain, which we use as a model system for studying the relationship of gene activity to histone modification. We observed furthermore a domain-wide loss of histone acetylation on both histones H3 and H4, as well as an increase in H3 Lys9 and Lys27 methylation, both marks associated with inactive chromatin. To determine whether the effect on acetylation was directly related to the loss of H4 Arg3 methylation, we performed an in vitro acetylation reaction on chromatin isolated from PRMT1-depleted cells. We found that nucleosomes purified from these cells, and depleted in methylation at Arg3, are readily acetylated by nuclear extracts from the same cells, if and only if the nucleosomes are incubated with PRMT1 beforehand. Thus, methylation of histones by PRMT1 was sufficient to permit subsequent acetylation. Consistent with earlier reports of experiments in vitro, H4 Arg3 methylation by PRMT1 appears to be essential in vivo for the establishment or maintenance of a wide range of "active" chromatin modifications.     

Histone acetylation and deacetylation in senescent human diploid fibroblasts

We measured the kinetics of histone H4 hyperacetylation and kinetics of deacetylation for all core histones in young and senescent human diploid fibroblast-like cells. Both cell populations contained a fraction of histone H4 characterized by very rapid acetylation and deacetylation. The kinetics of these reactions were similar in young and senescent cells. The distribution of acetylated species of core histones was also similar in young and senescent human diploid fibroblast-like cells. These results indicated that previously-reported alterations in chromatin template activity in senescent cells were due to a mechanism other than histone acetylation.     

mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌细胞中的相互作用

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路与组蛋白乙酰化在人胃癌细胞生存活力、细胞周期、相关基因及蛋白表达方面的相互作用。方法分别单独或联合脱乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)、mTOR抑制剂雷帕霉素和PI3K抑制剂LY294002干预人胃癌MKN45和SGC7901细胞,以噻唑蓝法检测细胞生存活力,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR检测p21WAF1基因表达情况,蛋白免疫印迹检测Akt、p70S6K及4E-BP1蛋白表达情况。结果联合用药比单独用药对胃癌细胞生长抑制作用更明显(P<0.01);不管单独或联合用药,均可使MKN45细胞阻滞在G2期(P<0.05),使SGC7901细胞阻滞在G1或G2期(P<0.05);联合用药比单独用药更能提高抑癌基因p21WAF1的表达;联合用药使Akt、p70S6K及4E-BP1磷酸化表达较单独用药显著下降(P<0.01),联合用药后组蛋白H4/H3乙酰化也较单独用药表达升高(P<0.01)。结论mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌的发生发展中存在相互关系,mTOR抑制剂与脱乙酰化酶抑制剂联合应用具有协同作用,可望成为肿瘤基因防治的新靶点。     

膀胱移行细胞癌细胞周期调节相关基因表达与肿瘤生物学行为的关系

目的：探讨细胞周期调节相关基因p16INK4,p21WAF／CIP1,p53mlt在膀胱移行细胞癌中的表达与肿瘤增殖能力,病理分级及临床分期的关系。方法：应用免疫组织化学技术分析77例膀胱移行细胞癌组织p16INK4,p21WAF/CIP1,p53mlt基因的表达和增殖细胞核抗原（PCNA）表达情况,并与病理分级及临床分期之间进行综合分析。结果：p16INK4,p21WAF/CIP1,p53mlt在膀胱移行细胞癌中的表达及PCNA增殖指数与肿瘤的病理分级有关,与临床分期无关。p16,p21,p53阳性组与阴性组分别比较,其PCNA增殖数之间有差异性。多因素分析发现,p16INK4和p21WAF／CIP1阴性及p53mlt阳性组的PCNA值明显高于p16INK4和p21WAF／CIP1阳性及p53mlt阳性组,两者比较不同病理分级的阳性表达构成比亦有显著性差异。结论:联合检测p16INK4,p21WAF/CIP1,p53mlt基因的表达情况能充分反映膀胱移行细胞癌的增殖能力及生物学行为,对膀胱移行细胞癌患者的预后判断及治疗有指导意义。