TSA通过组蛋白乙酰化影响TLR2基因表达

目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Trichostatin A,TSA)处理人THP-1细胞,干预组蛋白H3乙酰化水平,探讨组蛋白H3乙酰化对人THP-1细胞中TLR2基因表达水平的影响。方法构建THP-1巨噬细胞模型,分别利用不同浓度TSA处理细胞,Real-time PCR和Western blot方法检测m RNA和蛋白的表达;染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)比较TSA处理前后启动子区H3乙酰化水平。结果TSA以浓度依赖方式上调表达水平。TSA上调组蛋白H3乙酰化水平,使启动子区H3乙酰化水平明显上升。结论 TSA通过组蛋白H3乙酰化影响基因表达,这是乙酰化调控TLR2基因表达的一种可能机制。     

5-Aza/TSA表观遗传处理诱导非霍奇金淋巴瘤B细胞表型丢失

目的:探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷/曲古抑菌素A(5-Aza/TSA)介导的DNA去甲基化/组蛋白乙酰化处理对B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤B细胞表型的影响。方法:构建含有G418抗性的CD19特异性启动e GFP表达载体,转染霍奇金(阴性对照)和非霍奇金淋巴瘤细胞,并筛选目的序列稳定整合的克隆,比较CD19启动子在2组细胞中的活性。流式细胞术检测5-Aza/TSA处理对2组细胞GFP表达水平的影响。分离Eμ-myc转基因小鼠非霍奇金淋巴瘤原代细胞并鉴定其B细胞表型,通过流式细胞术检测5-Aza/TSA对其B细胞表面抗原CD19等表达水平的影响。结果:5-Aza/TSA表观遗传处理能够降低人非霍奇金淋巴瘤细胞中外源性CD19启动子的转录活性,并沉默小鼠原代非霍奇金淋巴瘤细胞表面B细胞特异性抗原的表达。结论:DNA甲基化和组蛋白去乙酰化对人类及小鼠B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤B细胞表型稳定有重要作用。     

Islet-1诱导成纤维细胞系C3H10T1/2向心肌细胞分化过程中组蛋白乙酰化与DNA甲基化在GATA4启动子区的关系

目的研究在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的心肌早期发育相关基因GATA4启动子区域组蛋白乙酰化与DNA甲基化的相互作用关系。方法构建过表达Islet-1细胞模型,在GATA4基因表达过程中,用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测其启动子区组蛋白H3K9乙酰化的时序性变化;甲基化特异性PCR技术(MSP)检测其启动子区Cp G岛甲基化的时序性变化,明确两者之间相互作用的关系。结果随着Islet-1诱导C3H10T1/2向心肌细胞特异分化的时间延长,GATA4基因的表达增高(P0.05),其启动子区第2个Cp G位点组蛋白H3K9乙酰化的水平升高(P0.05),DNA甲基化水平降低(P0.05)。结论 Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞特异分化过程中,组蛋白乙酰化和DNA甲基化在调控心肌特异早期转录因子GATA4表达过程中存在相互拮抗作用,从而促其表达呈时序性变化。     

启动子甲基化调控NK-92MI细胞KIR3DL1基因表达

目的:观察NK细胞系NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化模式及去甲基化和组蛋白乙酰化对基因表达的影响,探讨KIR3DL1基因的表达调控机制.方法:采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷和(或)组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂曲古抑菌素A处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化和组蛋白乙酰化,观察启动子区CpG岛甲基化和组蛋白乙酰化与KIR3DL1基因表达的关系.结果:NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区高甲基化,CpG二核苷酸甲基化频率在70%～100%之间;应用终浓度为2.5 μmol/L和5 μmol/L的5-氮胞苷作用72 h可以诱导NK-92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量分别增加66.6%和114.6%;单用终浓度为50 nmol/L的曲古抑菌素A不能诱导NK-92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量增加;此外,曲古抑菌素A和5-氮胞苷联用与单用5-氮胞苷相比也没有协同作用.结论:NK-92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控.     

氧化应激上调人神经母细胞瘤细胞内β-裂解酶的表达

目的研究氧化应激对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)β-裂解酶(BACE1)表达的影响及组蛋白乙酰化、DNA甲基化的改变。方法采用H2O2处理体外培养的SH-SY5Y,Western blot法检测细胞的BACE1表达及DNA甲基转移酶(DNMTs)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达;实时定量PCR检测BACE1 mRNA的表达;吸光度值法检测组蛋白3(H3)和组蛋白4(H4)整体乙酰化水平。结果 SH-SY5Y细胞经H2O2处理1和72 h后BACE1 mRNA和蛋白表达均明显增多;H2O2处理72 h后DNMT1、DNMT3A表达均下降,分别是对照组的75%和65%(P<0.01);而组蛋白去乙酰化酶HDAC3的表达增高至对照组的1.6倍(P<0.01);同时,组蛋白H3整体乙酰化水平下降,但H4乙酰化水平无明显改变。结论氧化应激可能通过改变SH-SY5Y细胞内DNA甲基化水平及组蛋白乙酰化状态调节BACE1的表达,在阿尔茨海默病发病过程中发挥作用。     

高糖诱导人肾小球系膜细胞CTGF启动子去甲基化及基因表达

目的:观察高糖刺激和甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dCyd)对人肾小球系膜细胞(HMCs)结缔组织生长因子(CTGF)基因启动子的甲基化水平和基因表达的影响.方法:用不同终浓度的5-aza-dCyd(0、1、2、5、10 μmol/L)刺激HMCs,于48h提取细胞基因组DNA、总RNA和蛋白质;用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L、30 mmol/L)刺激细胞,于0、24、48、72 h收集细胞;应用甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞CTGF基因启动子甲基化状态,RT-PCR检测CTGFmRNA表达,Western blot检测 CTGF 蛋白表达.结果:不同浓度5-aza-dCyd处理HMCs 48 h后,0、1、2、5 μmol/L 5-azadcyd组CTGF基因启动子呈半甲基化状态,均有微量CTGFmRNA和蛋白的表达,差异无统计学意义(均P＞0.05);10 μmol/L 5-aza-dCyd组甲基化条带阴性,呈完全去甲基化状态,CTGF mRNA和蛋白表达均增加,与0 μmol/L组比较差异有统计学意义(P＜0.01).5 mmol/L葡萄糖组HMCs各时间点CTGF基因启动子均呈半甲基化状态,表达微量CTGFmRNA和蛋白质,差异无统计学意义(均P＞0.05);30 mmol/L葡萄糖组CTGF启动子在0 h呈半甲基化状态,甲基化条带较强;24 h甲基化条带减弱,48 h甲基化条带阴性,呈完全去甲基化状态,24 h、48 h、72 h CTGF mRNA和蛋白质表达均增加,与5 mmol/L组相应时间点比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:高糖和甲基化抑制剂5-aza-dCyd均可诱导人肾小球系膜细胞CTGF基因启动子的去甲基化并增加CTGF的表达,提示DNA甲基化可能参与了人肾小球系膜细胞CTGF基因表达的调控.     

苯中毒病人TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白化学修饰改变

目的:研究拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)启动子调控因子SP1组蛋白化学修饰在苯中毒病人中的改变。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀技术探讨TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白乙酰化和甲基化水平的变化,RT-PCR法测定Sp1 mRNA的表达水平。结果:与对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4和H3乙酰化水平下降(P0.01),组蛋白H3K9甲基化水平升高(P0.01),组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变。与正常对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1的mRNA表达水平降低(P0.05)。结论:慢性苯中毒TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰水平的改变伴随着mRNA水平的变化。TOPOⅡα启动子调控因子Sp1可能通过组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰改变在苯中毒所致的造血毒性中发挥作用。     

应用染色质免疫沉淀技术分析DNMT3b和HDAC1蛋白与SLC22A18基因启动子的结合

目的 建立优化的染色质免疫沉淀技术(ChIP),分析乳腺癌细胞MDA-MB-231中DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)与SLC22A18基因启动子区的结合情况. 方法 建立并优化ChIP实验技术,运用ChIP技术检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-dc)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)分别单独和联合作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,用Dnmt3b和HDAC1特异性抗体沉淀DNA,聚合酶链式反应(PCR)检测SLC22A18基因5＇端特异性序列,免疫印迹法(Western blotting)检测Dnmt3b和HDAC1蛋白的表达情况. 结果 获得了优化的ChIP实验条件,Dnmt3b和HDAC1抗体沉淀的染色质片段中扩增出SLC22A18基因5＇端特异性序列.5-aza-dc、TSA单独用药可抑制DNMT3b、HDAC1与SLC22A18启动子区特异序列的结合,5-aza-dc和TSA联合作用可以明显抑制DNMT3b、HDAC1与SLC22A18启动子的结合;Western blotting结果表明,5-aza-dc、TSA单独及联合用药不影响DNMT3b和HDAC1蛋白的表达. 结论 DNMT3b和HDAC1在MDA-MB-231细胞内结合于SLC22A18基因启动子的特异区域,参与该基因的表达调控.     

小鼠不同细胞间表观遗传修饰的变化对Pdx-1基因转录表达的影响

目的:通过比较小鼠不同细胞类型之间Pdx-1基因转录起始区的表观遗传修饰差异,探讨表观遗传修饰对Pdx-1基因转录表达的作用。方法:采用免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞和小鼠β细胞株NIT-1细胞Pdx-1和MLH1基因转录起始区DNA甲基化和组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述3种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的DNA甲基化水平、H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果:(1)以mES细胞为对照,NIT-1细胞的Pdx-1基因转录起始区呈低DNA甲基化和高H3K4m3修饰(P0.05),NIH3T3细胞的Pdx-1基因的转录起始区的DNA甲基化、H3乙酰化、H3K4m3和H3K9m3修饰水平明显增高(P0.05);(2)Pdx-1基因仅在NIT-1细胞表达,其表达与DNA甲基化存在等级负相关(r=-0.802,P0.01),与H3K4m3修饰存在直线相关(r=0.997,P0.01),与H3K9m3修饰存在等级负相关(r=-0.879,P0.01);(3)管家基因MLH1的表达与所检测的表观遗传修饰无相关性。结论:DNA甲基化、H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控Pdx-1基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要意义。     

HIV-1感染引起组蛋白乙酰化和增加p21WAF1表达

目的：DNA甲基化和组蛋白乙酰化是基因表达调控的主要形式。人类免疫缺陷病毒（HIV-1）可引起T淋巴细胞DNA甲基化酶上调。本文旨在明确HIV-1对细胞周期依赖刺激酶抑制剂p21^WAF1表达的影响。方法：建立HIV-1感染的Hut78细胞系；以RT-PCR和Westem blotting 分析p21^WAF1表达情况；以亚硫酸氢钠修饰DNA和基因测序，研究p21^WAF1基因启动子甲基化，以Western blot-ting 和染色体免疫测定探究总组蛋白和与p21^WAF1基因启动子相关的组蛋白乙酰化水平。并以GST pull-down和免疫沉淀分析HIV-1导致乙酰化及乙酰化引起p21^WAF1过表达的可能机理。结果：HIV-1感染后，其反式激活蛋白Tat与辅助转录因子P/CAF、hGCN5结合，共同刺激组蛋白H3乙酰化。尽管p21^WAF1启动子部分区域有甲基化发生，但p21^WAF1表达仍上调。这可能与E2A对p21^WAF1的作用有关。结论：HIV-1感染可引起T淋巴细胞p21^WAF1基因的甲基化和乙酰化紊乱，导致p21^WAF1表达增强。     

组蛋白去乙酰化调控软骨细胞Ⅱ型胶原表达的机理研究

目的　探讨通过TSA抑制组蛋白去乙酰化水平,研究组蛋白去乙酰化对软骨细胞表型相关基因的影响及其机制,从表观遗传学角度为维持软骨细胞表型提供新的思路。 方法 体外培养人关节软骨细胞,建立软骨细胞去分化模型,采用不同浓度TSA刺激,在不同时间点收集细胞,提取总RNA,利用qRT-PCR检测Wnt-5a、SOX-9、COL-Ⅱ、COL-Ⅰ的mRNA表达情况。利用免疫荧光及Westerblot进行COL-Ⅱ蛋白表达水平的检测。 结果　与对照组比较,TSA（0.25~1.0 μmol/L）显著降低COL-Ⅱ mRNA表达水平及蛋白表达水平,升高Wnt-5a 和SOX-9 mRNA表达水平;抑制Wnt-5a信号通路减弱TSA 对COL-Ⅱ的抑制效应。 结论 TSA通过激活Wnt-5a和 SOX-9从而抑制COL-Ⅱ的表达,导致软骨细胞表型丧失。因此,组蛋白去乙酰化通过降低Wnt-5a和SOX-9,升高COL-Ⅱ的表达水平,发挥维持软骨细胞表型的作用。     

曲古霉素A促进胶质瘤细胞系凋亡

目的组蛋白的异常修饰(去乙酰化)与胶质瘤的发生和发展关系密切,本研究的目的是探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichomycin A,TSA)对胶质瘤细胞系凋亡的调节作用。方法将浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L的TSA加入胶质瘤细胞系U251细胞中,应用Westernblot法检测U251细胞系经不同浓度的TSA处理后细胞内胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3),乙酰化组蛋白H3和H4的表达,应用流式细胞术(Annexin V-FITC染色)检测不同药物浓度处理组中U251细胞的凋亡率。结果 TSA处理后,U251细胞内乙酰化组蛋白H3、H4及caspase-3的蛋白水平明显上调(P<0.01),具有明显的剂量依赖性。流式细胞术结果显示U251细胞TSA处理后细胞的凋亡率具有剂量依赖性显著上调。结论 TSA剂量依赖性上调胶质瘤细胞系U251中caspase-3表达,促进细胞凋亡。     

5-杂氮-2'脱氧胞苷对肝癌细胞SMMC-7721 miR-1247-5p基因表达及其启动子区甲基化的影响

目的观察正常人肝细胞系LO_2和肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p的表达,研究去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达及其基因启动子区Cp G岛甲基化水平的影响。方法用不同浓度(0、5和10μmol/L)去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷处理SMMC-7721细胞,用甲基化特异性PCR法检测miR-1247-5p基因启动子区甲基化水平;用SYBR Green qReal Time PCR法检测miR-1247-5p的表达。结果与正常人肝细胞系LO_2相比,肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达降低(P0.05)且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平高;经去甲基化药物干预后miR-1247-5p的表达较对照组有明显上调(P0.01),且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平降低。结论 miR-1247-5p基因甲基化调控可能参与了肝癌的发生。     

小鼠大脑亚硝酸盐暴露与DNA甲基化和组蛋白去乙酰化

目的 观察慢性亚硝酸盐暴露对小鼠大脑皮质炎症损伤的影响及其探讨DNA甲基化和组蛋白去乙酰化等相关机制。方法 选取8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠,随机分为对照组（生理盐水）、低剂量亚硝酸盐组（3g/L）和高剂量亚硝酸盐组(6g/L),建立亚硝酸盐暴露模型,收集各组小鼠大脑皮质,利用免疫荧光染色法和Western blotting法分析大脑皮质炎症损伤,组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基化相关酶的表达情况。结果 慢性亚硝酸盐暴露后小鼠大脑皮质炎症损伤因子环氧化酶2（COX2）、白细胞介素-1β（IL-1β）、离子钙接头蛋白分子1（Iba1）、c-Fos、IL-6表达量明显多于对照组（P<0.01）,同时高剂量暴露组DNA甲基化相关酶5-甲基胞嘧啶（5-mC）、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3a、和组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）表达明显低于对照组（P<0.01）且都呈亚硝酸盐剂量依赖性。结论 亚硝酸盐暴露可通过促进细胞免疫炎症对小鼠大脑皮质造成损伤,并且DNA甲基化和组蛋白去乙酰化可能参与了慢性亚硝酸盐暴露过程中的应答过程及其调控机制。     

不同浓度曲古抑菌素A对鸡胚翅芽发育的影响

目的 观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对鸡胚翅芽发育中某些基因表达水平的作用,探讨不同浓度TSA(75μmol/L、750 μmol/L、1.5mmol/L)对鸡胚翅芽发育的影响,提高我们对染色质结构重组和表观遗传对基因表达的调控作用,以及对正在开发的抗癌药物的认识. 方法以鸡胚翅芽作为实验模型,用TSA处理翅芽,对鸡胚胎实施原位杂交,检测与肌肉发育相关基因的表达,并采用硫酸耐尔蓝(Nile bluesulfate)法检测细胞凋亡状况. 结果 75 μmol/L TSA能够抑制与肌肉发生相关的基因MyoD和Myf5在鸡胚翅芽的表达,经TSA(75μmol/L)处理的胚胎没有发生明显的细胞凋亡.但是随着TSA药物浓度的提高,TSA(≥750μmol/L)不仅强烈抑制相关基因的表达,而且出现翅芽外部畸形(外形改变、体积缩小)以及细胞凋亡. 结论75μmol/LTSA调控某些重要的转录因子及有力地控制肌肉细胞的分化;高浓度TSA(≥750μmol/L)导致细胞凋亡和胚胎翅芽畸形;发育的鸡胚能够作为一个便利的,供体内研究药物(如HDAC抑制剂类等)的模型.     

全反式维甲酸诱导P19细胞系长非编码RNA Neat1基因表达

目的研究全反式维甲酸(atRA)诱导小鼠畸胎瘤P19细胞分化模型中LncRNA Neat1表达的变化,探究组蛋白修饰对其表达的影响。方法用含终浓度为0.5μmol/L atRA的培养基诱导P19细胞分化,检测神经分化标志物Mash1的mRNA表达;利用RT-q PCR检测在P19细胞神经分化过程中LncRNA Neat1的表达变化;利用组蛋白修饰调控因子抑制剂曲古柳菌素(TSA)、烟酰胺(NAM)、腺苷二醛(Ad Ox)处理P19细胞,观察对Neat1表达的影响。结果成功建立atRA诱导的P19神经分化模型,神经分化标志物Mash1在P19分化过程中表达上调;诱导过程中Neat1表达显著上调(P0.01),Ⅰ类和Ⅱ类去乙酰化酶抑制剂TSA可诱导Neat1表达,但Ⅲ类去乙酰化酶抑制剂NAM和甲基转移酶抑制剂Ad Ox对Neat1的表达无显著影响。结论全反式维甲酸诱导P19分化过程中,LncRNA Neat1表达显著上调,维持组蛋白高乙酰化状态的去乙酰化酶抑制剂TSA可参与促进Neat1的表达。     

人结肠癌细胞系中癌相关基因的表达及表型遗传修饰的影响

目的 观察DNA甲基化和组蛋白乙酰化对人结肠癌细胞系癌相关基因的表达和细胞周期的影响。方法 培养2种结肠癌细胞系SW1116和Colo-320，分别以去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-dC)和(或)组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂trichcxstatin A(TSA)及丁酸盐干预细胞。提取细胞总RNA，以RT-PCR和定量RT-PCR法研究抑癌基因p16^INK4A、APC、p2^WAF1、p53和p73以及癌基因c-myc和c-Ki-ras、凋亡抑制基因survivin mRNA表达水平；并运用流式细胞术检测细胞周期变化。结果正常情况下，SW1116和Colo-320细胞系中均有较弱的p16^INK4A和APC表达；两种结肠癌细胞系p21^WAF1表达缺如，而p53、p73和c-myc、c-Ki-ras以及survivin均表达。以5-aza-dC干预后，p16^INK4A和APC表达增强，且不同的结肠癌细胞系表达增强最明显时5-aza-dC干预的时间与浓度不同。相反p21^WAF1仍无明显表达。值得注意的是这两个细胞系经TSA或丁酸盐处理后，p21^WAF1转录水平显著上调。p53、p73、c-myc、c-Ki-ras和survivin基因在干预前后表达无明显变化。另外，5-aza-dC并不能改变细胞周期，而TSA或丁酸盐使细胞阻滞于G1期。结论 两种人结肠癌细胞系中，p16^INK4A和APC基因的表达均受甲基化调节；p21^WAF1基因表达主要受乙酰化调节，乙酰化使细胞周期停滞于G1期；而p53、p73、c-myc、c-Ki-ras和survivin基因的表达不受甲基化或乙酰化的调节。     

父代饮酒致子代小鼠心脏发育异常的组蛋白乙酰化修饰机制

目的:探讨父代饮酒对子代心脏发育的影响,以及组蛋白乙酰化修饰机制。方法:雄性C57小鼠给予连续酒精(体积分数40%,每天10 mL/kg)暴露6周,分别设空白对照组(无处理)及阴性对照组(生理盐水灌胃)。干预后雌雄小鼠合笼,收集新生子代小鼠心脏组织。测量新生小鼠出生体重;电镜检测心肌细胞超微结构;TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平;qPCR检测caspase-3及Bcl-2的mRNA表达水平;Western blot法检测active caspase-3、caspase-3及Bcl-2蛋白表达水平;ChIP-qPCR法检测caspase-3及Bcl-2启动子上组蛋白H3K9及H3K27乙酰化水平。结果:父代饮酒小鼠子代出生体重明显较对照组降低(P0.05);电镜下见酒精组新生小鼠心肌细胞出现肌丝溶解、肌浆网扩大和肌丝排列紊乱;同时其凋亡细胞较对照组明显增多;酒精组caspase-3 mRNA表达较对照组显著升高(P0.05),active caspase-3蛋白水平较对照组显著升高(P0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白均较对照组显著降低(P0.05);caspase-3基因启动子组蛋白H3K9乙酰化水平较对照组显著升高(P0.05);Bcl-2启动子组蛋白H3K27乙酰化水平较对照组显著降低(P0.05)。结论:父代饮酒可以引起子代小鼠心脏发育异常。组蛋白乙酰化修饰可能介导了子代小鼠心肌细胞凋亡过程。     

启动子区DNA去甲基化增强子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞MMP-9的表达

目的研究子宫内膜异位症中基质金属蛋白酶9(MMP-9)基因表达的DNA甲基化调控机制。方法采用甲基化特异性PCR检测在位与异位子宫内膜组织中MMP-9 mRNA的表达,采用免疫组织化学染色检测在位与异位子宫内膜组织中MMP-9蛋白的表达。原代培养子宫内膜异位基质细胞,细胞经5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理后,分析MMP-9基因的表达及其启动子甲基化状态。结果异位子宫内膜组织中MMP-9 mRNA和蛋白的表达高于在位子宫内膜组织。异位子宫内膜组织中MMP-9基因启动子区DNA甲基化水平低于在位子宫内膜组织。5-Aza-dC处理异位子宫内膜细胞后,MMP-9的表达水平升高,MMP-9基因启动子区出现明显的去甲基化。结论 MMP-9基因启动子区DNA去甲基化增强子宫内膜异位症患者异位内膜基质细胞中MMP-9的表达。     

miR-30a-5p启动子区DNA甲基化在同型半胱氨酸致肝损伤中的作用

目的:探讨微小RNA-30a-5p(miR-30a-5p)启动子区DNA甲基化在肝损伤中的作用。方法:随机选取4周龄胱硫醚β-合成酶(CBS)基因正常(CBS+/+)小鼠(n=12)及单基因敲除(CBS+/-)小鼠(n=12),均给予高蛋氨酸饮食8周。HL-7702细胞体外常规培养,分为对照(control)组、同型半胱氨酸(Hcy)组和Hcy+5-氮杂胞苷(AZC)组。全自动生化分析仪检测小鼠血清Hcy、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;微板法测定肝细胞ALT和AST水平;小鼠肝脏石蜡切片行HE染色观察肝脏损伤情况;细胞活力染色检测肝细胞活力;RT-qPCR法检测小鼠肝脏组织和肝细胞中miR-30a-5p的表达;Pearson相关性分析肝脏miR-30a-5p表达与血清ALT和AST水平的相关性;巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测小鼠肝脏组织以及肝细胞中miR-30a-5p启动子区DNA甲基化水平的变化。结果:与CBS+/+对照组相比,CBS+/-组小鼠血清的Hcy、ALT和AST水平显著升高(P<0.05);HE染色显示肝细胞肿胀,可见核碎裂、溶解;肝脏miR-30a-5p表达明显降低(P<0.01);小鼠肝脏组织中miR-30a-5p的表达与血清ALT和AST的水平呈负相关(r2=0.4557,P=0.0003;r2=0.4626,P=0.0003);miR-30a-5p启动子区DNA的甲基化水平升高(P<0.01)。在细胞水平,与control组相比,Hcy组的ALT和AST水平升高(P<0.05,P<0.01),细胞活力显著降低,肝细胞miR-30a-5p启动子区DNA的甲基化水平升高(P<0.01),而使用AZC后miR-30a-5p启动子区DNA的甲基化水平降低(P<0.05),miR-30a-5p的表达上调(P<0.05)。结论:miR-30a-5p启动子区DNA高甲基化可能在肝损伤中发挥重要作用。