基于表面等离子体共振原理的核酸检测技术

目的 建立基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器的核酸检测技术,为实时、在线检测航天微生物奠定技术基础.方法 应用本实验室建立的便携式生物分子在线分析系统(portable online bio-molecules analyzer,POBA),在传感器表面固化探针分子,对溶液中的靶序列进行杂交检测,研究该检测方法的灵敏度、特异性及可重复性等.结果 实验中建立的核酸检测方法能够实现对靶序列的实时检测,检测下限达2.3 nmol/L,进行9次杂交检测的变异系数为3.5%,重复进行30次检测的变异系数为14.7%.结论 本实验建立的核酸检测方法,具有灵敏度高、特异性强、可重复性好等优点,SPR传感器技术在核酸杂交检测工作中有着广阔的应用前景.     

不同粒径的Au纳米粒子对SPR技术定量分析灵敏度的影响

目的通过比较不同粒径金纳米粒子(Au NPs)对表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)系统信号放大的影响,筛选最适粒径的Au NPs,从而建立一种新的SPR方法用于猕猴血清中西妥昔单抗(C225)定量分析。方法利用柠檬酸还原HAuCl4法自行制备3种粒径Au NPs并分别与羊抗人IgG进行偶联,将偶联物引入BI-Acore系统进行SPR信号采集,筛选最适粒径的Au NPs,进而利用BIAcore系统建立猕猴体内C225定量分析标准曲线。结果自行制备的Au NPs形状相对圆润,大小均一。几种粒径的Au NPs均能引起SPR信号放大,但粒径不同则SPR信号放大情况不同,其中10 nm Au NPs的SPR信号放大作用最为明显。结论将特定大小的Au NPs引入SPR定量分析系统能够显著提高SPR信号强度,从而进一步提高SPR定量分析灵敏度。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139

目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性。方法:选择EHEC O157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(u idA);霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(glycosotransferaseLPSgt)基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰。在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果:PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。     

不同粒径的Au纳米粒子对SPR技术定量分析灵敏度的影响

目的通过比较不同粒径金纳米粒子（Au NPs）对表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）系统信号放大的影响,筛选最适粒径的Au NPs,从而建立一种新的SPR方法用于猕猴血清中西妥昔单抗（C225）定量分析。方法利用柠檬酸还原HAuCl4法自行制备3种粒径Au NPs并分别与羊抗人IgG进行偶联,将偶联物引入BI-Acore系统进行SPR信号采集,筛选最适粒径的Au NPs,进而利用BIAcore系统建立猕猴体内C225定量分析标准曲线。结果自行制备的Au NPs形状相对圆润,大小均一。几种粒径的Au NPs均能引起SPR信号放大,但粒径不同则SPR信号放大情况不同,其中10 nm Au NPs的SPR信号放大作用最为明显。结论将特定大小的Au NPs引入SPR定量分析系统能够显著提高SPR信号强度,从而进一步提高SPR定量分析灵敏度。     

实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR.方法 依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出＜10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1 000倍.用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性.用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性.结论 该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒.     

一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立

目的 建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变.方法 通过比对分析GenBank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率.野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准.用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证.结果 直接测序法检出16例(4.7％)阳性样本.标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15％的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准.用新方法检出47例(13.8％)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0％的样本38例,＜1.0％的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均＜1.0％.用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0％作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9％,阴性符合率为100％,两种方法的一致性Kappa值为0.671.结论 与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性.该方法对建立,BV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴.     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

高热处理哺乳动物细胞后,照射或不照射时DNA单链断裂的发生情况

高热是否可以直接诱发DNA单链断裂,文献意见尚不一致。Lunec等报告,高热处理的细胞来检测到DNA单链断裂。Dikomey等指出,高热或45℃以上处理的细胞,在37℃培养4～24小时便可出现DNA单链断裂。自从~6H-胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)用于实验细胞的DNA标记以来,认为DNA单链断裂可以由0H的内照射而诱发。为了探讨DNA单链断裂的原因,本文报告了EA(Ehrlich ascites)和HeLa S_3细胞在高热下处理后,X线照射与不照射时DNA单链断裂的发生情况。验证了是高热本身的直接或间接作用,还是标记DAN的~3H-TdR的~3H内照射诱发DNA单链断裂。同时也讨论了高热与辐射诱发的DNA单链断裂修复抑     

应用寡核苷酸芯片技术检测IGF-Ⅱ基因SNP方法的建立及其在运动能力相关基因研究中的应用

目的 :杰出运动能力受控于基因与环境的相互作用 ,由多基因控制。寡核苷酸芯片技术是近年出现的一类基因结构分析技术 ,此项技术出现使基因突变检测更加程序化和规模化。本研究选取与运动能力有关的胰岛素生长因子Ⅱ (IGF -Ⅱ )基因为该方法学及其应用研究的突破点 ,尝试把DNA芯片技术引入体育科研。方法 :寡核苷酸芯片技术。结果 :(1)IGF -Ⅱ基因SNP的分析中 ,基因组DNA采用 1∶2 0的套式扩增 ,杂交液中加氯化四甲氨 ,杂交温度 4 2℃ ,杂交时间 6 0min效果最好 ;(2 )国家自行车队的 6名队员基因型相同。结果表明 :(1)PCR产物可以直接用于检测突变 ,不对称PCR产物杂交阳性点信号更强 ;(2 )由碱基组成计算的Tm值与其实际的Tm值有一定的差距 ,会影响杂交温度 ;(3)有效的DNA载波片的处理效果直接影响杂交结果 ,是芯片制备中关键环节之一 ;(4)IGF -Ⅱ是研究运动能力相关基因的一个很好的候选基因。