红色糖多孢菌A226-SP突变体构建及代谢产物分析

目的：构建红色糖多孢菌突变菌株,生物合成酮内酯类抗生素。方法：利用反向PCR技术,扩增红色糖多孢菌KR6酮还原酶基因突变DNA片段SP（KR6酶中Gly^1141Ala^1142替换成SerPro）,克隆于pWHM3上构建染色体同源重组质粒pWHM3-SP。通过PEG介导原生质体转化,将pWHM3-SP导入红色糖多孢菌中。经染色体二次重组后,筛选出1株红色糖多孢菌KR6酶突变菌株A226-SP。结果：DNA序列分析表明,A226-SP染色体上编码KR6酶中Gly^1141Ala^1142序列GGTGCG突变成SerPro编码序列AGCCCT。HPLC—HRMS分析证实A226-SP菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B（DOEB）,同时检测到其中间产物C18H34O6,但没有发现红霉素产物。结论：Gly^1141Ala^1142位于KR6酮还原酶的重要功能位点,红色糖多孢菌A226-SP突变体可以合成酮内酯类化合物。     

糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体的构建及其产物鉴定

目的：构建糖多孢红霉菌KR6酶域基因失活突变体，探讨SRR氨基酸相应9核苷酸去除突变体与合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的关系。方法：以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，用重叠PCR技术扩增出缺少SRR氨基酸相应9核苷酸的KR6酶域DNA片段，并克隆到载体pWHM3上，构建了同源重组质粒pWHM3-SRR。将pWHM3-SRR质粒转化糖多孢红霉菌λC3菌株，筛选出质粒整合到染色体上红霉素合成基因位点的整合体λC3-A、B和C。λC3-A在无硫链丝茵肽(Thio)的R3M斜面上生长两代后，制备的原生质体涂R3M平皿，挑选出不能在含Thio的R3M斜面上生长、发酵液也无抑制枯草芽孢杆菌活性的突变菌株λC3-SRR。结果：部分基因组DNA序列分析表明，糖多孢红霉菌λC3-SRR染色体上SRR氨基酸相应9核苷酸已经敲除，Zabspec Fab质谱分析证实λC3-SRR菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B。结论：糖多孢红霉菌KR6酶域SRR氨基酸相应9核苷酸敲除的λC3-SRR突变菌株可以合成3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，SRR为KR6酶域上NADPH2′-磷酸结合位点。     

红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体的构建及产物分析

目的构建红色糖多孢菌糖基转移酶EryCⅢ失活突变体,为探索红霉素糖基结构修饰和合成新型红霉素衍生物打下基础。方法通过PCR扩增方法将eryCⅢ基因缺失130bp后,克隆至同源重组型质粒pWHM3上,构建pWHM3-ΔeryCⅢ,将其导入红色糖多孢菌A226中。经过两次同源重组,筛选出1株缺失EryCⅢ酶活性的红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体。使用抑菌实验、薄层层析和质谱对其发酵产物进行分析,并通过回补实验进一步验证。结果与结论对红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ染色体序列测定表明,eryCⅢ基因相应位点缺失130bp,突变菌株发酵产物对枯草芽孢杆菌无抑制作用,薄层和质谱结果表明突变菌株积累3-L-mycarose红霉内酯B（MEB）,而并没有发现红霉素产物。回补验证发现eryCⅢ基因导入A226-ΔeryCⅢ使得其恢复了红霉素合成能力。所构建的红色糖多孢菌EryCⅢ失活突变体A226-ΔeryCⅢ,为探讨组合合成红霉素衍生物奠定基础。     

产红霉素B红色糖多孢菌突变体的构建

目的：获得大量红霉素合成中间产物红霉素B,并进一步研究eryK基因的活性位点。方法：通过重叠PCR将eryK基因中包括BC环在内的关键氨基酸序列删除,克隆到同源重组质粒pWHM3上,继而通过染色体同源重组方法将EryK羟基化酶基因失活,构建了缺失C-12羟基化酶活性的红色糖多孢菌突变体。结果与结论：构建了红色糖多孢茵突变菌株AK17,对发酵产物进行TLC和MS分析,结果显示突变体主要合成红霉素B。     

红色糖多孢菌M合成3-脱氧-3-羰基-赤酮酸内酯B的限速因子研究

目的探讨红色糖多孢菌KR6基因突变体生物合成3-脱氧-3羰基-赤酮酸内酯B（DOEB）产量显著降低的原因。方法以KR6基因突变体M菌株为研究对象,采用相对实时荧光定量RT-PCR技术、抗原-抗体检测技术和高分辨LC-MS分析技术等,分别从基因的转录水平、翻译水平以及聚酮化合物水平等层面研究了DOEB的生物合成量。结果红色糖多孢菌M菌株与出发菌株A226相比,两者聚酮合酶（PKS）基因簇在转录水平和翻译水平上的表达差异均非造成DOEB产量降低的限速因子;而DOEB的前体转化能力却大幅度降低,因此,DOEB合酶的活力降低是造成生物合成DOEB产量降低的关键因素。结论 DOEB合酶的活力是生物合成DOEB的限速因子,本研究为进一步探讨利用基因工程途径提高新酮内酯类化合物产量奠定了基础。     

bldD基因过量表达对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响

目的通过增加红色糖多孢菌调控基因bldD拷贝,获得红霉素高产菌株,并探讨bldD基因过量表达对红色糖多孢菌形态分化的影响。方法以红色糖多孢菌A226为出发菌株,通过染色体同源重组方法获得红色糖多孢菌A226bldD基因失活突变菌株A226-△bldD。将bldD基因表达质粒pZMW-bldD分别导入突变株A226-△bldD及出发菌株A226中,获得A226-△bldD/bldD菌株和A226/bldD菌株,利用TLC法和HPLC法对其发酵产物进行分析,并观察孢子生长状况。结果红色糖多孢菌A226中bldD基因失活后产红霉素水平明显降低,不能形成孢子;bldD基因的回复表达使A226-△bldD突变菌株产红霉素能力得到恢复,且孢子形成恢复正常;在红色糖多孢菌A226中过量表达bldD基因可提高红霉素产量,较出发菌株A226提高20%,同时可使孢子形成时间提前。结论在红色糖多孢菌中过量表达bldD基因,可获得红霉素高产菌株,同时会影响红色糖多孢菌形态分化进程。     

红色糖多孢菌ΔSACE_0065,ΔSACE_2559和ΔSACE_2565突变体构建及对孢子分化的影响

目的构建红色糖多孢菌ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变体并研究其功能。方法将待失活目的基因的上下游同源片段依次连接到pUCTSR质粒Thio抗性基因（tsr）两侧,利用PEG介导的原生质体转化法将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌A226内,通过同源重组使目的基因失活,最后将构建出的三个突变株与出发菌株A226及ΔbldD突变株进行比较,观察孢子生长有无差异。结果与结论成功构建ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变株;与A226相比,ΔSACE_0065和ΔSACE_2559气生菌丝和孢子形成推迟,而ΔSACE_2565突变株的生长情况则无明显变化,提示红色糖多孢菌SACE_0065、SACE_2559基因参与其形态分化的调控。     

红色糖多孢菌染色体基因快速失活技术研究及应用

目的：研究红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术。方法：以Thio抗性基因（tsr）作为筛选标记,在其上下游分别连接失活目的基因两侧同源片段,利用PEG介导原生质体转化将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌,通过tsr基因两侧同源片段与染色体同时重组,将目的基因敲除或失活。结果：tsr基因两侧同源片段长度与红色糖多孢菌染色体同源重组效率密切相关,同源片段长度在500 bp左右时,线性片段与染色体有效重组率很低,而同源片段长度超过1000 bp时,可获得有效的基因失活突变菌株。通过这种技术构建的红色糖多孢菌ΔbldD基因突变体,合成红霉素产量显著降低,说明bldD参与红霉素合成基因调控。结论：红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术,对于分析红色糖多孢菌基因功能具有重要作用。     

红霉素3-O-甲基转移酶基因eryG克隆及表达

目的:探索红色糖多孢菌红霉素eryG基因在大肠杆菌中的最佳表达条件.方法:以红色糖多孢菌总DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b( )上,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.从诱导剂IPTG的终浓度和诱导时间两个因素来优化eryG基因的表达条件.结果:eryG基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物EryG经SDS-PAGE分析相对分子质量约为33×103.表达条件经优化后,重组蛋白EryG表达量占菌体总蛋白的55%以上.结论:红色糖多孢菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌中高效地表达,为进一步研究EryG的相关酶学性质、分析其对红霉素发酵产物的影响奠定了基础.     

metK、vhbS和adpA的串联表达提高红色糖多孢菌红霉素产量的研究

目的在红色糖多孢菌（S.erythraea,SE）中串联表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK、透明颤菌血红蛋白基因vhbS和多效调控蛋白基因adpA,构建红霉素高产的工程菌株。方法通过PEG介导的原生质体转化方法,将携带metK、vhbS和adpA基因片段的整合型质粒导入红霉素野生菌株SE的A226及工业菌株WB中,安普霉素抗性筛选与PCR鉴定获得工程菌株,并利用枯草芽孢杆菌抑菌实验与高效液相色谱分析比较出发菌株及其工程菌株的红霉素产量。结果与结论成功构建4株A226衍生菌株A226-P1～P4与3株WB衍生菌株WB-P1～P3。相比野生菌株A226,工程菌株A226-P1～P4的相对红霉素效价提高了8%～25%,其红霉素A产量增加了64%～94%。同样,工程菌株WB-P1～P3的相对红霉素效价与红霉素A产量较出发菌株WB都有明显提高,分别增加了6%～10%与31%～62%。说明metK、vhbS和adpA的串联表达提高SE的红霉素产量具有普适性。     

红色糖多孢菌表达载体pZW的构建

目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率.方法:以pSET152和pET-22b( )为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW.结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP).结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因.