表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）在人体内半衰期过短限制了其应用。目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

构建和鉴定神经生长因子-β腺相关病毒穿梭质粒

目的 构建能够表达神经生长因子-β重组腺相关病毒穿梭质粒,为进一步包装腺相关病毒奠定基础.方法 利用高保真酶分别扩增pAAV-MCS的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连人T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,T4酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;培养人MIApaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人ngf-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-ngf-β;将ngf-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒.结果酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4250 bp、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白表达;质粒T-easy-ngf-β酶切可见3 kb、736 bp条带,测序显示基因序列正确;酶切pAAV-U6/CMV-ngf-β可见4300 bp、736 bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-ngf-β测序显示载体中的基因序列正确.结论 成功构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒,包装表达神经生长因子的腺相关病毒,为进一步深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础.     

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增（PCR）目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH—KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT—PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。     

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16.1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达.方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4 DNA Ligase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP.重组质粒经酶切及测序鉴定.将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果.结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达.结论:成功构建真核表达质粒DENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制.     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体及在HepG2细胞中的表达

背景:内皮脂肪酶主要由血管内皮细胞分泌并作用于血管内皮,内皮脂肪酶可能在动脉粥样硬化等疾病的发生发展中起重要作用,但目前机制尚不明确。目的:构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体,产毒感染HepG2细胞,评价重组载体提高内皮脂肪酶表达的效果。方法:RT-PCR调取大鼠内皮脂肪酶基因,SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切后,将内皮脂肪酶基因插入慢病毒载体PRRL.sin.CMV.eGFP中构建内皮脂肪酶过表达慢病毒表达载体PRRL.sin.CMV.EL-eGFP;使用PRRL.sin.CMV.EL-eGFP质粒及病毒包装系统于293FT细胞中包装产毒,用于感染HepG2细胞,RT-PCR及Westernblot检测感染后HepG2细胞内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。结果与结论:酶切及测序鉴定证实内皮脂肪酶基因成功插入PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒;转染PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒后,HepG2细胞中可见内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。说明重组PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒可感染HepG2细胞,并使其表达内皮脂肪酶mRNA和蛋白。     

Tiam1基因慢病毒表达载体构建及其在HT29细胞中的表达

目的:构建Tiam1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒表达载体,观察其在人结直肠癌HT29细胞中的表达.方法:通过酶切Tiam1/C1199HA质粒获得Tiam1 cDNA片段,并将其克隆到慢病毒载体表达质粒pCDF1-copGFP中,经酶切、测序鉴定.慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带Tiam1和GFP融合基因的重组慢病毒.取病毒上清感染人结直肠HT29细胞株,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白及免疫细胞化学检测Tiam1在靶细胞中的表达.结果:重组慢病毒质粒pCDF1-Tiam1-copGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的Tiam1基因序列(NM_003253)完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293FT细胞,病毒包装效率为88.34%.收获慢病毒上清可高效感染HT29细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,感染效率为55.89%,感染后靶细胞中Tiam1稳定高表达.结论:成功构建了携带Tiam1与GFP融合基因的慢病毒表达栽体pCDF1-Tiam1-copGFP,并使目的基因在靶细胞中得到稳定表达,为进一步研究Tiam1基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体.     

人血管内皮生长因子与绿色荧光蛋白标记双基因共表达AAV载体的构建及鉴定

背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.     

重组转化生长因子β1腺相关病毒感染骨髓基质干细胞的活性

背景：目前常用基因载体具有一定缺陷性,无法直接在体内应用。应用腺相关病毒作为转化生长因子β1载体促进软骨修复的研究报道较少。目的：构建重组转化生长因子β1腺相关病毒,测定病毒滴度,并测定重组病毒对骨髓基质干细胞的感染活性。方法：PCR方法扩增转化生长因子β1基因,构建重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞包装重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度并鉴定。并感染体外培养的兔骨髓基质干细胞,检测重组病毒感染骨髓基质干细胞的效率及活性。结果与结论：转化生长因子β1扩增产物测序结果正确,重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白双酶切后可见位于1.3Kb附近转化生长因子β1条带。收获病毒滴度5.2×1011v.g/mL。鉴定重组病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白包装成功。重组病毒感染骨髓基质干细胞后可于荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白的表达,感染效率达42%。结果证实,成功构建重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,能够高效感染兔骨髓基质干细胞。     

Production of recombinant adeno-associated virus vectors using a packaging cell line and a hybrid recombinant adenovirus.

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors are under consideration for a wide variety of gene therapy applications. One of the limitations of the rAAV vector system has been the difficulty in producing the vector in sufficient quantity for adequate preclinical and clinical evaluation. A common method for vector production involves large-scale transient transfection of multiple plasmids into cultured cells. Because this approach might not be feasible for clinical scale manufacturing, we have sought approaches for rAAV vector production that avoid transient transfection procedures. In previously reported work, we generated an AAV packaging cell line that produces infectious rAAV when the vector genome is transfected into the cell line as plasmid DNA. We have now extended this approach by constructing a hybrid recombinant adenovirus (rAd) that contains a complete rAAV vector genome in the E1 region. This hybrid virus is used to deliver the rAAV genome to the packaging cell line (in the place of plasmid transfection). rAAV is produced when the packaging cell line is infected with the hybrid adenovirus and wild-type adenovirus. This method avoids the need for plasmid transfection and is adaptable to large-scale manufacturing processes.     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以 PCR 及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×1011 v·g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×104 v·g/cel。在以1×104,5×104,1×105 v·g/cel 转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高（P 〈0.05）,4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。     

重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定

背景:有研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍,但相关BMP4/7融合基因的相关病毒载体的构建至今少有报道。目的:构建重组人BMP-4/7融合基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并检测其表达。方法:扩增BMP-4、7成熟肽基因;分别构建质粒pGEM-BMP-4和pGEM-BMP-7;采用DNA连接法获取BMP-4/7融合基因,克隆获得pGEM-BMP-4/7质粒,进行基因测序。AAV颗粒转染HEK293细胞,收获病毒载体AAV-BMP-4/7。用SDS-PAGE电泳检测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达。用不同感染复数的AAV-BMP-4/7转染骨髓间充质干细胞3d,提取细胞总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和ELISA法检测融合基因BMP-4/7在骨髓间充质干细胞中的表达。结果与结论:PCR电泳,酶切鉴定及测序结果表明,装入pSNAV质粒中的BMP-4/7基因正确,pSNAV-BMP-4/7重组成功。RT-PCR检测到骨髓间充质干细胞BMP-4/7融合基因的转录条带,ELISA检测显示经AAV转染的骨髓间充质干细胞中BMP-4/7蛋白随着感染复数的增加表达逐渐增高(P<0.01)。结果证实,实验成功构建重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体。     

携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

背景:细胞分裂周期2(cell division cycle 2,cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色.以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用.目的:包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV).设计、时间及地点:空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成.材料:Helper Free腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品.方法:应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-slRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP).病毒感染AAV-293细胞后行Western Blot检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度.主要观察指标:pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞; rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达.结果:①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中.②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功.③包装得到的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdC2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调AAV-293细胞cdc2基因的表达量.④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1×1012v.g/mL.结论:携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功.它具有沉默cdc2基因表达的功能.     

重组人造血干细胞因子基因在人造血干／祖细胞的转移和表达

目的：拓展造血干细胞因子（ＳＣＦ）的研究和基因治疗途径。方法：利用基因重组技术，构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７／ＳＣＦ，其病毒效价为（２．４～８．５）×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干／祖细胞。应用多聚酶链反应、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光－直接酶标法检测人ＳＣＦ基因在细胞中转移和表达。结果：逆转录病毒载体介导的ｒｈＳＣＦ基因在人造血干／祖细胞中获得有效转移和表达。结论：为进一步研究ＳＣＦ的生物学特性及开展干细胞移植等提供了一定的途径。     

Effective and safe gene-based delivery of GLP-1 using chitosan/plasmid-DNA therapeutic nanocomplexes in an animal model of type 2 diabetes

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is an incretin hormone that regulates blood glucose level post-prandially. It has been proposed that GLP-1 can be used in type 2 diabetes (T2D) mellitus treatment because of its insulinotropic action. Despite its remarkable advantages, GLP-1 suffers the disadvantage of an extremely short half-life owing to its degradation by the dipeptidyl peptidase IV protease. One way of overcoming this drawback is GLP-1 gene delivery. Here we show effective and safe gene-based delivery of GLP-1 using chitosan/plasmid-DNA therapeutic nanocomplexes (TNCs) in Zucker diabetic fatty (ZDF) animal model of T2D. The expression plasmid fused the GLP-1 gene to a Furin cleavage site was driven by a cytomegalovirus promoter/enhancer. TNCs were prepared by mixing this plasmid with chitosans of specific molecular weight (MW), degree of deacetylation (DDA) and ratio of chitosan amine to DNA phosphate (N:P ratio). Animals injected with the TNC chitosan 92-10-5 (DDA-MW-N:P) showed GLP-1 plasma levels of about fivefold higher than that in non-treated animals and the insulinotropic effect of recombinant GLP-1 was shown by a threefold increase in plasma insulin concentration when compared with untreated animals. Intraperitoneal glucose tolerance tests revealed an efficacious decrease of blood glucose compared with controls for up to 24 days after treatment, where injections of this formulation allowed near-normalization of blood glucose level. TNCs composed of specific chitosans and GLP-1-expressing plasmid constructs showed an impressive ability to harness the profound therapeutic potential of GLP-1 for the treatment of T2D mellitus.