抗凋亡基因NF-κB和Survivin对卵巢癌细胞株耐药性的诊断价值

目的:探讨凋亡抑制基因NF-κB、Survivin对卵巢癌细胞株耐药性的诊断价值。方法:采用卵巢上皮性癌细胞株A2780和由此细胞株诱导的耐顺铂细胞株AD4,分别加入顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol),并设空白对照,测定两组细胞中凋亡抑制基因核因子(NF-κB)、Survivin和多耐药基因(Mdr1)mRNA的表达;同时检测各组细胞的凋亡率。结果:经DDP处理后,Mdr1在两株细胞中均无明显表达,与G3PDH的比值均低于0.1;而Taxol作用后,Mdr1在两株细胞中表达均增加,与G3PDH的比值分别为1.98和1.86,但差异无显著性。NF-κB在各组细胞中均有表达,各组之间差异无显著性。Survivin有较强表达,与G3PDH的比值为4.5,耐药细胞株的比值为6.9。在两细胞株的不同实验中,Mdr1的表达与凋亡率无明显相关性,而Survivin则是负相关(P<0.05,r=-0.89)。结论:在卵巢癌及卵巢癌耐顺铂细胞株中,紫杉醇可诱导Mdr1高表达,而DDP对Mdr1表达无影响;NF-κB主要是通过活性增加,促进Mdr1表达来诱发卵巢癌细胞耐药;Survivin的表达与细胞凋亡率呈负相关,提示Survivin可作为肿瘤细胞耐药检测指标之一。     

微小RNA-16逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)在人上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达及其与顺铂耐药的关系。方法:脂质体lipofectamine2000介导miR-16成熟体模拟物(mimics)及阴性对照片段(NC)分别转染人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP。实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-16的表达;蛋白印迹法检测细胞中Bcl-2蛋白、c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50);caspase-3活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3酶的活性;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:(1)SKOV3/DDP细胞顺铂耐药指数(RI)为5.33;(2)SKOV3/DDP细胞中miR-16表达水平明显低于SKOV3细胞,约为后者的1/10(P=0.000),转染miR-16 mimics后SKOV3/DDP细胞中miR-16水平升高约660倍(P=0.001);(3)SKOV3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量较SKOV3细胞明显升高,转染miR-16 mimics后SKOV3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量明显降低(P<0.01);(4)SKOV3/DDP细胞转染miR-16 mim-ics后,顺铂IC50(14.19±0.06)较转染NC组(22.52±0.60)明显降低(P=0.002),且顺铂作用后caspase-3的酶活力单位也明显升高(P=0.000);(5)顺铂(20μg/ml)作用24h、48h后,SKOV3组凋亡率明显高于SKOV3/DDP组,转染miR-16 mimics的SKOV3/DDP细胞凋亡率约为转染NC细胞的1.5倍(P<0.01)。结论:miR-16可能通过靶向下调上皮性卵巢癌细胞Bcl-2蛋白,并协同调节c-myc蛋白的表达,增强卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性,发挥逆转耐药的作用。     

稳定转染短发夹状RNA后子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因表达的变化

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa细胞稳定转染表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒后,HeLa细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因(HPV18E6)表达的变化。方法实验组将本实验室前期构建的可遗传性表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒分别转染HeLa细胞,对照组以空质粒pSUPER和不加质粒的脂质体分别转染HeLa细胞。稳定转染后,氨基糖苷抗生素(G418)筛选阳性细胞克隆,RT-PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法分别检测HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达的变化。结果稳定转染后,G418筛选,实验组HeLa细胞有新的阳性细胞克隆形成,而对照组HeLa细胞最终全部死亡。实验组转染pE6-1shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA表达水平为0·76±0·28,明显低于对照组转染脂质体者(1·14±0·45)和转染pSUPER质粒者(1·12±0·23,P<0·05);HeLa细胞中HPV18E6蛋白阳性表达强度较对照组转染脂质体者弱。实验组转染pE6-2shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达水平分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0·05)。结论稳定转染表达HPV18E6shRNA的质粒后,宫颈癌细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达明显受到抑制。     

外源性FHIT基因表达对顺铂诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

目的:探讨外源性脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因表达与顺铂(cisplatin,DDP)是否可协同促进宫颈癌SiHa细胞的凋亡。方法:重组质粒PRcC-MV-FHIT(A组)及空质粒PRcCMV(B组)分别转染无内源性FHIT蛋白表达的SiHa细胞(未转染SiHa细胞为C组),Western Blot检测外源性FHIT蛋白的表达,使用不同浓度的顺铂分别处理各组细胞,通过AO-EB染色、流式细胞术检测顺铂处理后各组细胞的凋亡。结果:顺铂处理48h后进行流式细胞仪检测,重组质粒+DDP2.0μg/ml、未转染细胞+DDP2.0μg/ml及未用顺铂处理的重组质粒组凋亡率分别为51.03%、20.58%、22.07%,重组质粒+DDP组细胞凋亡更明显(重组质粒+DDP2.0μg/ml组与未转染细胞+DDP2.0μg/ml及未用顺铂处理的重组质粒组相比P<0.01),AO-EB染色亦见顺铂处理的重组质粒组凋亡细胞明显增多。结论:外源性FHIT基因表达与顺铂协同促进SiHa细胞凋亡,为基因治疗与化疗联合治疗宫颈癌提供理论基础。     

miR-200c通过靶向下调FOXC1逆转宫颈癌细胞顺铂耐药性的机制研究

目的:探讨miR-200c通过调控叉头框转录因子C1(FOXC1)影响宫颈癌细胞对顺铂敏感性的机制研究。方法:qRT-PCR法检测miR-200c在宫颈癌顺铂耐药组织和细胞中的表达水平。CCK-8和Annexin V-FITC/PI双染流式术检测过表达miR-200c对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响;双荧光素酶报告基因验证miR-200c与FOXC1的靶向作用关系;进一步实验,探讨miR-200c通过靶向FOXC1对HeLa/DDP细胞恶性生物学行为的影响。结果:miR-200c在宫颈癌耐药组织和HeLa/DDP细胞中均低表达。过表达miR-200c可显著抑制HeLa/DDP细胞增殖和促进细胞凋亡。双荧光素酶报告基因证实,miR-200c靶向作用FOXC1并下调其表达水平。过表达miR-200c通过靶向下调FOXC1进而显著抑制HeLa/DDP细胞增殖和诱导细胞凋亡,从而增强HeLa/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论:miR-200c通过下调FOXC1表达增强宫颈癌HeLa/DDP细胞对顺铂的敏感性。     

丙戊酸钠协同顺铂对HO8910细胞杀伤作用机制研究

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)协同顺铂(DDP)对人卵巢癌HO8910细胞的杀伤作用及机制。方法:以1μg/m l DDP联合3mmol/L VPA处理细胞,MTT法检测细胞生长抑制率;光镜下观察药物作用下各组细胞形态学的改变;流式细胞术检测细胞周期阻滞情况;RT-PCR法检测p53、p21 mRNA水平表达的改变;W estern blot法检测Ac-H3、p53、p21、Cyclin D1蛋白水平表达的改变。结果:(1)VPA能明显抑制HO8910细胞生长,且呈剂量和时间依赖性,VPA+DDP处理组抑制率高于DDP处理组,组间差异有统计学意义(P<0.05);(2)光镜下观察细胞形态,可见VPA处理组细胞体积缩小呈长梭型,胞膜皱缩,贴壁不良,VPA+DDP组改变更明显;(3)VPA阻滞卵巢癌HO8910细胞周期于G0/G1期,VPA+DDP组S期细胞明显减少;(4)VPA及VPA联合DDP均能够明显提高卵巢癌HO8910细胞组蛋白H3的乙酰化水平,上调p53、p21 mRNA及蛋白表达水平,降低CyclinD1蛋白的表达水平,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VPA能够协同DDP杀伤卵巢癌细胞HO8910;其作用机制可能与VPA提高组蛋白乙酰化水平,上调p53、p21基因表达和下调Cyclin D1表达,引发细胞周期阻滞有关。     

Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞系COC1/DDP耐药的关系

目的 探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP中抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达及半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western Blot分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达和caspase-3的活性。并用流式细胞术测定顺铂作用后COC1和COC1/DDP细胞株的凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,Bcl-XL和Bcl-2的表达明显高于COC1细胞;顺铂作用后,在COC1/DDP细胞株中细胞色素C的表达明显减少,caspase-3活性明显降低(P<0.05);其凋亡率也明显低于COC1细胞株(P<0.05)。结论:人卵巢癌细胞株COC1/DDP对顺铂产生耐药可能与细胞内Bcl-XL、Bcl-2过度表达抑制了线粒体细胞色素C的释放及caspase-3活性有关。     

Lactacystin及联合顺铂对子宫颈癌HeLa细胞的影响

目的探讨蛋白酶体抑制剂Lactacystin(LAC)及其与顺铂(DDP)联合对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞技术(FCM)检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率和凋亡率。细胞并分为4组:对照组、LAC组、DDP组及LAC+DDP,每组均干预HeLa细胞48h。结果MTT检测结果显示,LAC可有效抑制HeLa细胞的增殖,呈浓度(r=0.864,P0.05)及时间依赖性(r=0.926,P0.05),48h时的半数抑制量(IC_(50))为4.98μmol/L;与DDP组比较,LAC+DDP组对细胞增殖的抑制作用明显增强(P0.05)。DDP的IC_(50)由63.71μmol/L下降至28.93μmol/L。FCM检测结果显示,细胞凋亡率随LAC作用时间的延长而上升,具有时间依赖性(r=0.869,P0.05);与DDP组凋亡率[(17.49±3.82)%]和LAC组[(24.98±4.61)%]比较,LAC+DDP组[(38.06±5.72)%]诱导细胞凋亡的作用显著增强(P0.05)。结论蛋白酶体抑制剂LAC可有效抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖作用,并通过诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡,增强DDP对宫颈癌HeLa细胞株的作用。     

CO_2对人卵巢癌细胞株生长转移相关因子表达及顺铂敏感性的影响

目的:探讨体外模拟腹腔镜二氧化碳(CO2)气腹环境对人卵巢癌细胞株SKOV3生长转移相关因子表达的影响及CO2气腹环境作用后SKOV3对顺铂(DDP)敏感性的变化。方法:将体外培养的处于对数生长期的SKOV3细胞分为4组,即CO2组、DDP组、CO2+DDP组及对照组。用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)法及免疫细胞化学法检测各组细胞的PCNA、VEGF和CD44v6mRNA和蛋白的表达。结果:(1)CO2气体与顺铂间无交互作用(P0.05);(2)CO2处理组肿瘤细胞的PCNA、VEGF和CD44v6mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.01);(3)DDP组与对照组、CO2+DDP组与CO2组比较,DDP处理组肿瘤细胞的PCNA、VEGF和CD44v6mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.01,P0.01)。结论:CO2环境能促进人卵巢癌细胞株SKOV3生长转移相关因子表达;DDP对肿瘤细胞生长转移因子的表达有抑制作用;CO2环境作用后,肿瘤细胞对DDP敏感性的变化不明显。     

RNA干扰技术阻抑survivin基因表达对子宫颈癌细胞放射和化疗敏感性的影响

目的探讨利用RNA干扰(RNAi)技术阻抑survivin基因的表达,对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性和化疗敏感性的影响。方法通过脂质体介导,将含survivin基因小分子干扰RNA的重组真核表达质粒pSilencer2．1-s2、阴性对照质粒pSilencer2．1-NC和空载质粒pSilencer2．1-U6 neo转染宫颈癌细胞系HeLa,获得HeLa-s2、HeLa-NC和HeLa-U6 neo细胞,同时设未转染的HeLa细胞为阴性对照。RT-PCR技术、蛋白印迹法分别检测survivin mRNA和蛋白的表达水平,并计算survivin mRNA和蛋白表达抑制率;激酶活性检测法测定波长在405 nm处的吸光度(A405)值,表示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;平板克隆形成实验观察细胞的放射敏感性变化,以克隆形成率表示;四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率并计算顺铂的50％抑制浓度(IC50)。结果与HeLa-NC、HeLa-U6 neo及未转染的HeLa细胞比较,HeLa-s2细胞survivin mRNA和蛋白表达水平明显下降,survivin mRNA和蛋白表达抑制率分别为(62．8±0．3)％和(60．1±0．5)％。HeLa-s2细胞的A405值为1．261±0．043,未转染的HeLa细胞的A405值为0．314±0．012,两者比较,差异有统计学意义(P<0．05)。HeLa-s2与未转染的HeLa细胞相比,细胞凋亡率明显升高(P<0．05),分别为(29．23±1．41)％和(2．74±0．32)％。不同照射剂量下,HeLa-s2与未转染的HeLa细胞分别比较,克隆形成率均明显降低(P<0．05)。在同一顺铂浓度下,HeLa-s2与未转染的HeLa细胞比较,细胞存活率显著降低(P<0．05),HeLa-s2细胞对顺铂的IC50值较未转染的HeLa细胞下降显著(P< 0．05),分别为(0．873±0．021)和(9．212±0．033)μg／ml。结论利用RNAi技术可阻抑HeLa细胞中survivin基因的表达,增强caspase-3活性,诱导细胞凋亡,显著提高细胞的放射敏感性和对顺铂的化疗敏感性。     

Fn14活化凋亡增强人上皮性卵巢癌细胞顺铂敏感度的研究

目的：探讨成纤维细胞生长诱导因子14（Fn14）对人上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）细胞的顺铂（DDP）敏感度的影响及其可能机制。方法：蛋白质印迹（Western blotting）法检测EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中Fn14蛋白的表达情况,选择低表达Fn14蛋白的细胞株转染Fn14过表达质粒后,观察转染后细胞株的Fn14蛋白、凋亡相关蛋白caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的表达情况。CCK-8法检测细胞增殖能力及DDP半数抑制浓度（IC50）。流式细胞学检测细胞凋亡。结果：人EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中,A2780/DDP细胞株Fn14蛋白表达水平最低。Fn14过表达质粒转染A2780/DDP细胞后,细胞内Fn14表达水平上调（P＜0.05）;细胞的增殖能力无变化,但细胞DDP的IC50显著降低（P＜0.05）。流式细胞学检测结果进一步显示Fn14可以增加DDP诱导的A2780/DDP凋亡细胞数目。同时,Western blotting结果显示促凋亡蛋白caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降（P＜0.05）。结论：Fn14可能活化凋亡通路进而提高A2780/DDP细胞对DDP的敏感度。     

短发夹状RNA对卵巢癌细胞survivin mRNA表达及紫杉醇药物敏感性的影响

目的观察表达短发夹状RNA(shRNA)的mU6/survivin质粒转染卵巢癌细胞株OVCAR3细胞后,对OVCAR3细胞survivin mRNA表达的抑制作用,以及对OVCAR3细胞紫杉醇药物敏感性的影响。方法将表达绿色荧光蛋白的pEGFPC2质粒与脂质体按不同比例转染OVCAR3细胞,流式细胞仪检测其转染效率。根据转染效率最高时pEGFPC2质粒与脂质体的比例,将mU6/survivin质粒转染入OVCAR3细胞。实验分为3组未转染组、脂质体组、转染组,RT-PCR技术检测3组OVCAR3细胞中survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组OVCAR3细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50)。结果pEGFPC2质粒与脂质体按1∶2比例转染OVCAR3细胞时其转染效率最高,达23.6%。将mU6/survivin质粒与脂质体也按1∶2比例转染OVCAR3细胞24h后,未转染组、脂质体组、转染组细胞survivin mRNA的相对含量分别为0.81±0.05、0.79±0.12、0.26±0.04,转染组survivin mRNA相对含量下降至未转染组的32%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。转染组转染24h后,细胞凋亡率为(31.9±1.2)%,明显高于未转染组的(4.9±0.7)%和脂质体组的(5.6±0.5)%(P=0.000);转染组细胞周期被阻滞于G0/G1期,G2/M期减少,分别与未转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT比色法检测结果显示,未转染组、脂质体组、转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50分别为(0.305±0.032)、(0.157±0.031)、(0.019±0.001)μmol/L,转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50降低为未转染组的1/16,两组比较,差异有统计学意义(P=0.000)。结论shRNA可有效抑制卵巢癌细胞survivinmRNA的表达,并显著提高了卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。     

PTEN基因对卵巢癌耐药细胞系C13K顺铂耐药性的影响

目的:探讨第10号染色体上PTEN对人卵巢癌顺铂耐药细胞株C13K顺铂耐药性的逆转作用。方法:将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染人卵巢癌耐药细胞系C13K细胞,同时以转染空载体和未转染C13K细胞作为对照,分别应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(W estern blot)检测PTEN mRNA及蛋白表达水平,对转染细胞株进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验,观察PTEN基因对肿瘤细胞生长的抑制作用和C13K细胞对顺铂药物敏感性的影响,流式细胞仪(FACS)分析细胞的凋亡。结果:转染48 h后,与对照组相比,转染野生型PTEN基因能明显增加C13K细胞PTEN mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);MTT法显示,转染野生型PTEN基因的C13K细胞生长明显慢于转染空载体和未转染的C13K细胞,转染PTEN的C13K细胞对顺铂的敏感性显著增加;FACS分析显示,顺铂作用24h后,转染PTEN基因能够显著提高C13K细胞凋亡率。结论:转染野生型PTEN质粒能有效地提高C13K细胞内PTEN的表达,恢复细胞对顺铂的敏感性。     

自噬基因Beclin1抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的研究

目的:研究自噬基因Beclin1对裸鼠宫颈癌细胞株HeLa移植瘤的抑制作用。方法:将自噬基因Beclin1真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Beclin1经脂质体包裹后转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Westernblot检测其mRNA及蛋白水平的表达,MTT法检测细胞生长抑制率;将HeLa细胞接种于裸鼠右前肢腋下建立裸鼠人宫颈癌移植瘤模型,待瘤结节直径≥5mm后,分别以重组质粒pcDNA3.1(+)-Bec-lin1、pcDNA3.1(+)和生理盐水200μl每两天1次直接瘤内注射,连用3周后,测量3组肿瘤大小并观察肿瘤组织形态学改变。结果:pcDNA3.1(+)-Beclin1能使HeLa中Bec-lin1mRNA及蛋白表达增加(P<0.05),并显著抑制HeLa细胞的生长,呈现时间依赖性,与其余两组相比,有显著统计学差异(P<0.05);经重组质粒治疗21天后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相对于对照组瘤体明显缩小、瘤重明显减轻(P<0.05),病理检查可见,pcD-NA3.1(+)-Beclin1处理组瘤块内细胞坏死减少,结缔组织增生,而对照组中癌细胞分布呈弥漫性。结论:自噬基因Beclin1可以抑制HeLa移植瘤的生长。     

miR-101通过调节p-ERK1/2蛋白表达对SKOV3/DDP细胞行为活性的影响

目的:探讨miR-101表达对上皮性卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP行为活性的影响及相关作用机制。方法:上调SKOV3/DDP细胞中miR-101表达水平。RT-PCR法检测SKOV3/DDP细胞中miR-101 mRNA表达水平,CCK-8检测SKOV3/DDP细胞的顺铂敏感性,划痕实验检测SKOV3/DDP细胞的迁移力,Transwell实验检测SKOV3/DDP细胞侵袭力,Annexin V-FITC/PI流式细胞实验检测SKOV3/DDP细胞凋亡率,Western blot法检测SKOV3/DDP细胞p-ERK1/2、波形蛋白(Vimentin)、钙粘蛋白E(E-cadherin)及Caspase-3蛋白表达水平。结果:与各对照组比较,miR-101组SKOV3/DDP细胞miR-101mRNA表达水平明显升高(P0.05),顺铂敏感性明显增加,IC50显著降低(P0.05);划痕距离明显增宽(P0.05),透膜细胞数显著减少(P0.05);细胞凋亡率显著增高(P0.05),p-ERK1/2及Vimentin蛋白表达水平降低(P0.05),E-cadherin及Caspase-3表达水平显著升高(P0.05)。结论:高表达的miR-101可抑制SKOV3/DDP细胞中p-ERK1/2蛋白表达,同时抑制细胞行为活性,促进顺铂诱导的细胞凋亡。     

短发夹状RNA干扰对子宫颈癌细胞中Pin1基因表达及细胞增殖和凋亡的影响

目的研究短发夹状RNA(shRNA)干扰对宫颈癌细胞中Pin1基因表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pSIREN-Pin1,在脂质体介导下转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞(HeLa/p-shRNA组),同时以对照质粒pSIREN-Con(HeLa/p-Con组)和无血清培养基转染HeLa细胞(HeLa组)作为对照,分别应用RT-PCR技术及蛋白印迹法检测Pin1mRNA及蛋白表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和软琼脂细胞克隆实验检测细胞增殖状况,流式细胞仪分析细胞凋亡情况。结果转染后48h,HeLa/p-shRNA组Pin1mRNA及蛋白表达水平分别为0·19±0·05和0·33±0·14,HeLa/p-Con组分别为0·84±0·16和0·79±0·17,HeLa组分别为0·89±0·11和0·81±0·15,前组Pin1mRNA及蛋白表达水平分别与后两组比较,差异均有统计学意义(P<0·05);转染pSIREN-Pin1质粒后HeLa细胞中Pin1mRNA及蛋白表达抑制率分别为77%和58%。MTT比色法检测显示,HeLa/p-shRNA组细胞增殖率明显下降(P<0·05)。软琼脂克隆实验显示,HeLa/p-shRNA组细胞克隆小而稀疏,细胞克隆形成率为(12±3)%,明显低于HeLa/p-Con组的(20±5)%和HeLa组的(24±4)%(P<0·05)。流式细胞仪分析显示,HeLa/p-shRNA组细胞凋亡率为(24·3±5·7)%,明显高于HeLa/p-Con组的(5·0±1·4)%和HeLa组的(1·8±0·4)%(P<0·05)。结论shRNA干扰技术能有效抑制靶基因Pin1的表达,进而可抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡增加,为宫颈癌的基因研究及治疗提供新思路。     

Survivin gene RNA interference inhibits proliferation, induces apoptosis, and enhances radiosensitivity in HeLa cells

OBJECTIVE: Survivin is a new member of the inhibitors of apoptosis (IAPs) family. It is upregulated in various malignancies including human cervical carcinomas. Reduction of this molecule has resulted in chemosensitization, but it is uncertain whether it can lead to radiosensitization. We observed the effect of survivin gene RNA interference (RNAi) on the proliferation, apoptosis, and radiosensitivity of the human cervical carcinoma cells HeLa. STUDY DESIGN: Human cervical carcinoma cells (HeLa) were transfected with the specific siRNA expression vector (pSilencer2.1-s2) designed to target survivin mRNA. A corresponding site-mutated vector was constructed as a negative control (pSilencer2.1-NC). The expression of survivin mRNA and its protein among the stable transfected cells and the untransfected ones was detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting respectively. The cell growth was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cell cycle distribution and cell apoptosis were measured by flow cytometry. The changes in cell radiosensitivity were observed by clonogenic survival assay. RESULTS: Three stable transfected cell lines: HeLa-s2 (with pSilencer2.1-s2), HeLa-NC (with pSilencer2.1-NC), and HeLa-U6 neo (with empty vector pSilencer2.1-U6 neo) were established. The expression levels of survivin gene mRNA and protein in HeLa-s2 were significantly lower than in HeLa-NC, HeLa-U6 neo, and those untransfected HeLa cells. The expression inhibitory rates were 62.8% and 60.1%. The cell proliferation of HeLa-s2 was inhibited, and the highest inhibitory rate was 57.8+/-2.1%. The changes in cell cycle distribution in HeLa-s2 compared with the other three cell lines were obvious, many cells were blocked in the G(0)/G(1) phase 72.7+/-3.1% (P<0.05), reduced sharply in the G(2)/M phase (5.1+/-2.9)% (P<0.05), and also the apoptotic rate was 29.2+/-1.4%, obviously increasing (P<0.05). At the same dose of radiation, the cloning efficiency of HeLa-s2 declined notably (P<0.05); the cell survival curve showed a significant decrease in D(0) and D(q), which were 3.15 and 1.21, respectively (P<0.05), and the radiation enhancement ratios were 2.01 (a ratio of D(0)) and 1.77 (a ratio of D(q)). CONCLUSIONS: Survivin gene RNAi not only could inhibit the proliferation of human cervical carcinoma cells (HeLa), but also could significantly enhance the radiosensitivity of those cells through the reduction of its mRNA and protein. Therefore, an RNAi-targeted survivin gene strategy would be a potential approach to radiosensitization therapy in human cervical carcinomas.     

siRNA靶向沉默CXCR4基因对人卵巢癌SW626细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默趋化因子受体4(CXCR4)基因对卵巢癌SW626细胞增殖、迁移及侵袭的影响,为卵巢癌的基因治疗提供新的理论依据。方法:构建CXCR4干扰RNA质粒载体,重组扩增后转染CXCR4阳性的人卵巢癌细胞株SW626,以RT-PCR和Western blot检测CXCR4基因及蛋白表达的变化,MTT检测CXCR4干扰质粒对卵巢癌细胞增殖的影响,Transwell检测CXCR4干扰质粒对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响。结果:转染48h后,人卵巢癌细胞株SW626的转染效率为80%～90%,抑制了卵巢癌细胞CXCR4基因及蛋白的表达(P<0.05),部分抑制了癌细胞的增殖(P<0.01),但此作用并不随时间变化而有明显变化;癌细胞的迁移及侵袭率均明显下降,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论:CXCR4 siRNA可通过下调CXCR4的表达抑制人卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭。