孕妇外周血分离胎儿有核红细胞与FISH分析技术在无创性产前诊断中的应用

目的:应用流式细胞仪从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞(NRBCs),通过荧光原位杂交(FISH)分析进行无创性产前诊断。方法:对15例妊娠11～24周的高危孕妇外周血按常规密度梯度方法分离单个核细胞,选用红细胞特异性抗体CD71、HbF结合流式细胞术(FACS)分选富集NRBCs,并进行FISH分析。结果:所有标本均分选出NRBCs,分选率为100%,CD71和HbF双阳性细胞含量为(3.43±1.62)×10-2。经FISH成功分析13例,未发现异常结果。结论:从孕妇外周血中分离富集得到的胎儿有核红细胞,通过FISH分析检测胎儿特定的染色体,可进行无创性产前诊断遗传性疾病。     

利用3种抗体流式分选母血中胎儿细胞的比较

目的比较单克隆抗转铁蛋白受体抗体(CD71McAb)、单克隆抗血型糖蛋白A抗体(GPAMcAb)和抗血红蛋白-ξ抗体(ξ-Hb)3种胎儿有核红细胞(FRBCs)特异性抗体在流式细胞仪上分选母血中胎儿细胞的检出率,评价分选胎儿细胞的最适方法。方法收集55例孕妇外周血,利用淋巴细胞分离液从中分离出单个核细胞层后,每例标本分为5组,分别加入不同抗体第1组CD71Mchb单用;第2组GPAMcAb单用;第3组ξ-Hb单用;第4组CD71+GPA联用;第5组CD71+GPA+ξ-Hb联用,孵育后流式细胞仪进行分选,应用PEP-PCR检测分选后的胎儿细胞的SRY基因。结果5组FNRBC的阳性细胞检出率及鉴定符合率分别为2.74%,77.14%;5.25%,65.4%;0.22%,95.7%;0.72%,98.6%;0.02%,60%。结论利用CD71McAb和GPAMcAb双重标记胎儿细胞进行分选或者利用抗ξ-Hb特异性McAb分选FRBCs是更有效的分选方法。     

应用磁激活细胞分选法从母血中分离胎儿有核红细胞做FISH行无创性产前诊断的研究

目的:尽管胎儿有核红细胞在母血中含量甚微,但它的存在却为无创伤性产前基因诊断提供了潜在资源。本研究意在建立一种利用从母血中分选出的胎儿有核红细胞进行无创伤性产前基因诊断的方法。方法:抽取14例妊娠18~32周的拟行产前诊断的孕妇外周血20m l,分别进行单梯度密度离心、用CD14、CD45、CD71标记的阴性和阳性免疫磁珠分选、K le ihaur-Betke(K-B)染色和荧光原位杂交(FISH)。结果:所有标本均分选出胎儿有核红细胞(nuc leated red b lood cell,NR-BC),并经K-B染色和FISH鉴定。由FISH确定的胎儿性别,经脐带血培养染色体核型分析鉴定,结果显示该方法判定男胎的敏感度为100%,特异度为92.86%;判定女胎的敏感度为92.86%,特异度为100%。结论:应用磁珠分选母血中的胎儿细胞,并通过FISH标记进一步检测胎儿特定染色体行无创性产前诊断的方法有重要的临床应用价值。     

孕妇外周血胎儿细胞的分析及在产前诊断中的应用

孕妇外周血中存在胎儿细胞共四种 :滋养叶细胞、有核红细胞、粒细胞和淋巴细胞。胎儿有核红细胞最适合富集、纯化及用于产前诊断。利用有核红细胞特异性抗原标记CD71、CD36、及抗GPA、抗γ珠蛋白阳性选择及白细胞抗原CD45阴性选择分离胎儿有核红细胞 ,用FISH及PCR技术进行遗传学分析 ,已能在产前诊断出胎儿性别 ,一些染色体异常及血红蛋白等疾病     

引物原位标记技术标记胎儿细胞的可行性探讨

目的探讨引物原位标记技术(PRINS)对脐血中胎儿有核红细胞(NRBC)进行标记的可行性。方法15例足月孕妇外周血经不连续密度梯度离心、制片,行PRINS技术标记胎儿细胞,显微镜下识别并计数。结果发现15例孕妇脐血细胞涂片中每例均有阳性杂交信号出现;阳性率为100%(15/15)。30张正常对照组的外周血细胞涂片中仅1例出现阳性杂交信号;阴性率为96%(29/30),假阳性率仅为4%(1/30)。结论实验结果提示PRINS法对于用脐血中分离到的胎儿细胞进行无创性产前诊断具有可行性。     

单抗CD71纳米免疫磁性颗粒的制备及鉴定

目的:制备能特异地与靶细胞结合并具有磁响应性的单抗CD71纳米免疫磁性颗粒(单抗CD71-MNP)。方法:在EDC的作用下,将单抗CD71与磁性纳米颗粒进行共价偶联;将单抗CD71-MNP加入到脐血单个核细胞悬液中,磁性富集有核红细胞;免疫细胞化学法鉴定单抗CD71-MNP特异性。结果:制备的单抗CD71-MNP能敏感而较特异地与靶细胞结合,假阳性率低。结论:单抗CD71-MNP能有效地从脐血中分离出有核红细胞,为无痛性产前诊断奠定基础。     

孕妇外周血中胎儿细胞分离富集技术的进展

孕妇外周血中确实存在胎儿细胞,包括有核红细胞,滋养层细胞,淋巴细胞和粒细胞。可采用密度梯度离心、荧光激活细胞分选术、磁激活细胞分选术、体外培养、显微吸取术等数种方法将胎儿细胞分离富集出来,目前胎儿有核红细胞是最佳靶细胞,荧光激活细胞分选术分离效果最好。     

孕妇外周血中胎儿细胞分离富集技术的进展

孕妇外周血中确实存在胎儿细胞，包括有核红细胞，滋养层细胞，淋巴细胞和粒细胞。可采用密度梯度离心、荧光激活细胞分选术、磁激活细胞分选术、体外培养、显微吸取术等数种方法将胎儿细胞分离富集出来，目前胎儿有核红细胞是最佳靶细胞，荧光激活细胞分选术分离效果最好。     

21058 先兆子痫发生前母血中有核红细胞计数升高

[英]/WoHgang Holzgreve…∥Am J Obstet Gynecol.-2001,184.-165-168. 妊高征是妊娠相关的高血压疾病,其病因不清,发病率为10%,仍是孕产妇和新生儿死亡的主要原因.目前尚无可靠方法在早期筛选妊高征之高危孕妇,以采取预防措施.有研究报道,先兆子痫孕妇和胎儿有核红细胞计数升高,研究者采用富集孕妇外周血中胎儿细胞这一无创伤的方法作为产前诊断,做了该项前瞻性研究,以确定在先兆子痫临床症状出现之前是否有核红细胞计数已升高. 对象和方法:由于子宫动脉血流减少是发生先兆子痫和胎儿宫内发育迟缓(IUGR)的高危因素,故对孕妇在妊娠中期(19～24周)常规进行双侧子宫动脉的多普勒超声检查.研究组为单侧或双侧子宫动脉血流减少的43个孕妇,采血15mL.对照组包括子宫动脉血流正常的51个孕妇及未做多普勒超声检查的3个孕妇.采血时平均孕周为21±3周.既往无高血压病史,间隔4小时测量血压≥140/90mmHg(18.7/12.0kPa),同时伴有蛋白尿者,诊断为先兆子痫. 胎儿细胞的富集:采用磁性分离法富集有核红细胞.简言之,用磷酸钠缓冲液稀释后,加入相等容积的1077 Ficoll Paque,以800转/分的速度离心20分钟.用抗-CD71-结合柱富集有核红细胞.用血细胞计数器计数有核红细胞,富集的有核细胞用磷酸钠缓冲液洗涤后,以细胞离心法分离,移入玻璃玻片,May-Grunwald-Giemsa染色法染色.有核红细胞的分数是计数1000个有核细胞中有核红细胞的个数,即有核红细胞的个数＝有核细胞的个数×有核红细胞的分数. 结果:研究组15例孕妇发生先兆子痫,9例发生IUGR而未发生先兆子痫,其余21例孕妇无任何并发症.对照组除了1例孕妇发生IUGR外,其余无任何并发症. 富集的有核红细胞数目与妊娠结局相关.子宫动脉血流减少但最终无并发症的孕妇,其有核红细胞数目与子宫动脉血流正常的孕妇无差异(186.7 Vs 1140.0,P=0.154).发生IUGR的病例与对照组相比,有核红细胞数目无明显升高(355.6 Vs 928.9,P=0.772).研究结果表明,发生先兆子痫的孕妇在妊娠中期血有核红细胞的数目已升高(6041.7 Vs 928.9,P=0.008). 讨论:发生先兆子痫的孕妇,在妊娠早期外周血中的有核红细胞就已明显升高.虽然该研究没有区分有核红细胞是来自胎儿还是母亲,但既往用荧光原位杂交和单细胞多聚酶联反应研究发现,母亲外周血中有核红细胞大部分来自胎儿.因此,研究结果表明,胎儿细胞在孕早期就进入母亲外周血中者,后期会发生先兆子痫.因为先兆子痫的最初病理机制可能是胎盘植入缺陷,滋养细胞不能有效侵入蜕膜层重铸母体螺旋动脉,这些都与胎儿细胞漏入母体有关. 尽管IUGR与先兆子痫有关,但发生IUGR未发生先兆子痫的孕妇,其血中有核红细胞数目并未升高,这表明IUGR和先兆子痫的病因有基本的不同,并且与胎盘功能异常有关的胎-母细胞交流的紊乱可能是先兆子痫,而不是IUGR的一特异性特征.母亲外周血中有核红细胞是否可作为先兆子痫的预测指标,需进一步探讨. (张淑萍 白丽萍摘 苟文丽审校)     

密度梯度离心法富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞的方法学

目的 探讨密度梯度离心法(density gradient centrifugation，DGC)富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞的可行性及其在产前基因诊断中的价值。方法 采用密度梯度离心法富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞，以流式细胞分析鉴定富集细胞，同时对富集前后孕妇外周血DNA进行男性性别决定基因(sex—determining region Y，SRY)检测。结果 5例孕妇外周血单个核细胞靶细胞群糖蛋白A(glycophorinA，GPA)阳性细胞富集前平均含量为0．02‰～0．1‰，而富集后平均含量高达0．5％～2．8％；24例孕10～40周孕妇(包括以上5例)中，孕妇外周血DNA富集前SRY基因男性诊断符合率69．2％(9／13)，诊断总符合率83．3％(20／24)，而富集后分别为84．6％(11／13)，91．6％(22／24)，11例怀女胎的孕妇富集前、后均未检出SRY基因。结论 密度梯度离心法可从孕妇外周血中富集胎儿细胞，且所得细胞已基本满足体外扩增单拷贝基因所需的模板量，该方法可应用于非损伤性产前诊断。     

First attempts of detecting fetal cells in the maternal circulation

INTRODUCTION: In prenatal diagnosis there is great interest for noninvasive diagnostic methods. Authors report their first results in detecting fetal cells in the maternal circulation during pregnancy. OBJECTIVE: The aim of the study was to detect fetal gender from maternal peripheral blood samples during pregnancy. METHOD: Authors have analysed fetal nucleated red blood cells. In 12 cases after a double density Percoll gradient separation they labelled the surface antigens of the cells with anti-glycophorin-A and anti-CD45 fluorescent antibodies, did an intracellular staining of the epsilon haemoglobin chain, and analysed the cells with flow cytometry. The CD45 negative/glycophorin-A positive/epsilon-haemoglobin chain positive cells were considered as fetal cells. Having the results, in another 13 cases magnetic activated cell sorting with CD71 antibody were used as an enrichment step. Authors made an intracellular staining of the epsilon haemoglobin chain, the positive cells were isolated by micromanipulation, and analysed by single cell fluorescent polymerase chain reaction. Primers for the amelogenin gene were used to detect fetal gender. RESULTS: Only the Percoll enrichment step itself is not enough for using the samples for diagnostic molecular-biologic examinations, a following enrichment step is needed. For this the authors used magnetic activated cell sorting with CD71 antibody. With the help of this enrichment step, after the intracellular staining of the epsilon haemoglobin chain the direct micromanipulator isolation of the epsilon haemoglobin chain positive cells could be done. After analysing single cells by fluorescent polymerase chain reaction, in 8 out of the 11 comparable cases the results were similar to those, what was found during the genetic amniocentesis. In 2 cases from this 8, genetic amniocentesis proved Klinefelter syndrome, which they could also confirm with the examination of fetal cells in the maternal circulation. CONCLUSION: The results of the study suggest that the method described above can be useful in prenatal genetic diagnosis, and improving it could be useful to detect other genetic abnormalities (chromosomal abnormalities, single gene disorders) as well.     

基于免疫分选的T淋巴细胞亚群嵌合性定量分析

目的:建立基于免疫分选的T淋巴细胞亚群嵌合性定量分析的方法。方法:以淋巴细胞不同比例混合制备14组人工嵌合体血样,以免疫磁珠阳性选择法获取CD4+和CD8+T细胞亚群,分选后的细胞再进行16位点的短串重复序列(STR)多态性分析。结果:分选后T细胞亚群提取的DNA量能满足STR检测要求,当嵌合体中受体比例≥10%时,16个STR位点均能检出受体和供体特异性等位基因,按照STR峰面积计算的受体比例与理论值相符;当受体比例≤1%时,仅有部分位点能检出受体特异性等位基因,实测嵌合率与理论值存在差异。结论:建立了基于免疫分选的T细胞亚群嵌合性定量分析方法,可用于造血干细胞移植术后嵌合体监测。     

孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞产前诊断胎儿ABO血型

目的:探讨母血中单个胎儿有核红细胞(NRBCS)产前诊断胎儿ABO血型的可行性。方法:从154例孕妇外周血中分离单个NRBCS,应用引物延伸扩增(PEP)法扩增单个NRBCS的基因组,用PCR法检测扩增产物中的SRY基因以判断NBRCS的来源。再用特异性序列-聚合酶链反应(PCR-SSP)法测胎儿ABO血型基因型。抽取新生儿脐血提取淋巴细胞,应用PCR-SSP法测胎儿ABO血型基因型。用常规血清方法测新生儿血型。结果:用PCR-SSP法检测出154例中的152例血型,2例未测出,检出率98.7%。检测出的152例胎儿基因型与脐血淋巴细胞所测ABO血型基因型完全相符。常规血清学方法测新生儿ABO血型,检测率为85.7%。结论:用单个NRBCS结合PCR-SSP法检测胎儿ABO血型方法可靠。     

卵巢癌患者外周血CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞及Foxp3的检测及临床意义

目的:检测CD4+CD25high调节性T细胞(Treg)及Foxp3在卵巢癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达,探讨其在抗肿瘤免疫调节中的作用及临床意义。方法:采用流式细胞术检测75例卵巢癌患者PBMC中CD4+CD25+/CD4+、CD4+CD25high/CD4+T细胞百分比以及CD4+CD25+及CD4+CD25highT细胞中Foxp3+T细胞的表达,并与73例正常对照组进行比较。结果:卵巢癌患者治疗前PBMC中CD4+CD25+/CD4+、CD4+CD25high/CD4+T细胞百分比及Foxp3表达水平均较正常对照组增高(P<0.05),治疗后上述指标较治疗前减低(P<0.05)。结论:卵巢癌患者外周血调节性T细胞增高可能是其免疫异常的主要原因之一,定期检测外周血中上述指标的变化有助于了解卵巢癌患者的病情变化及判断预后。     

青春双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌对急性期和恢复期结肠炎小鼠Th1/Th2亚群的影响

目的 分析急性期和恢复期实验性结肠炎小鼠外周血Th1/Th2亚群比例以及青春双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌对其影响.方法 40只BABL/c小鼠自由饮用7d DSS造成急性实验性结肠炎小鼠模型,随机分为4组:阴性对照组(NS)、阳性对照组(SASP)、青春双歧杆菌组(BF0624)、嗜酸乳杆菌组(LT0637),10只/组,以及正常对照组(N)10只(未造模).一部分在实验第8天处死采血;另一部分继续正常饮水10 d,在实验第18天处死采血;分离淋巴细胞,用流式细胞术三色法测定Th1/Th2亚群比例.结果 正常小鼠外周血Th1/Th2比例在0.84-0.96之间,而DSS诱导的急性结肠炎小鼠Th1/Th2比例增加,NS组达到2.21±0.83.在恢复期同样处于较高的水平;青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌能逐渐降低实验性UC小鼠的Th1/Th2比例,特别是嗜酸乳杆菌在恢复期可以使比例达到接近正常小鼠水平.结论 DSS诱导的急性期和恢复期结肠炎小鼠外周血Th1/Th2比例较正常小鼠增加,青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌能降低Th1/Th2比例,嗜酸乳酸杆菌效果更优.     

实验性抗磷脂综合征小鼠CD4~+CD25~+调节性细胞及foxp3表达的变化

目的:观察实验性抗磷脂综合征(experimental anti-phospholipid antibody syndrome,EAPS)进展过程中小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)数量和功能变化。方法:以重组人β2糖蛋白1(rhβ2GP1)主动免疫BALB/c小鼠建立实验性APS模型,免疫12周后检测抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2-GP1)、抗心磷脂抗体(ACA)、流产率(%)、活化部分凝血活酶时间(aPTT)、血小板计数(PLT PBC)。以流式细胞术检测小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg细胞频率,RT-PCR检测转录因子Foxp3 mRNA的表达水平。结果:模型小鼠anti-β2-GP1、aCL水平明显升高,aPTT延长,PLT PBC降低,流产率提高,差异有统计学意义(P0.05)。模型小鼠PBMC中foxp3基因表达在4周短暂高于对照组(P0.05),8周后随着APS进展开始逐渐降低,12周后明显低于对照组(P0.05)。PBMC中CD4+CD25+Treg细胞频率8周前与对照组相比差异无统计学意义(P0.05),12周后逐渐减少,明显低于对照组(P0.05)。结论:CD4+CD25+Treg数量和功能下降参与抗磷脂综合征的发病机制。     

HbF水平在β-地中海贫血携带者妊娠期产前筛查中的应用

目的研究胎儿血红蛋白HbF与妊娠和β-地贫的关系。方法采集妊娠与非妊娠期女性外周血,进行HbF血红蛋白电泳分析。同时提取外周血基因组DNA,应用反向斑点杂交技术进行基因分析。分别比较HbF增高在妊娠组与非妊娠组、正常组与β-地贫组、非妊娠组内β-地贫与正常样本、妊娠组内β-地贫与正常样本和β-地贫组内妊娠与非妊娠样本间的统计学差异。结果不同β-地贫突变类型人群的HbF增高比例也不同,其中-28突变的HbF增高病例占所有HbF增高病例的比例最大(39.39%),IVS-П-654、CD27-28、CD41-42和CD17也都呈现出不同的HbF增高比例,而其他的突变类型的增高情况较少。HbF增高率的差异在各分组间均有统计学意义,但其增高水平之间的差异则仅在正常组与β-地贫病例组间有统计学意义。结论 HbF增高率在β-地贫携带者妊娠期与非妊娠期、健康女性妊娠期与非妊娠期均有明显差异,β-地贫携带者在妊娠期的HbF水平增高水平更高,这些现象对β-地贫产前筛查中有积极的指导作用。