凝血因子Ⅷ复合物的纯化

本文介绍一种制备高纯度凝血因子Ⅷ(FⅧ)复合物的方法。用新鲜冰冻血浆作为原始材料,收集冷沉淀,溶解后经氢氧化铝[Al(OH)_3]凝胶吸附、甘氨酸沉淀和氯化钠沉淀,得高纯 FⅧ。然后经 Sephacryl S-1000柱层析,收集富含 FⅧ促凝活性(FⅧ∶C)及 von Willebrand 因子(vWF)组分,得到进一步纯化的产品。层析后产品总蛋白含量为0.188mg/ml,FⅧ∶C 为15.43IU/ml,FⅧ相关抗原(FⅧR∶Ag)为9.85U/ml,vWF 的 Ristocetin 辅因子活性(FⅧR∶RCof)为24.2U/ml。火箭电泳测定未显示含有纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)、纤维结合蛋白(Fibronectin,Fn)和IgG 等杂蛋白。     

人凝血因子Ⅷ新型离子交换树脂的筛选及吸附性能的研究

目的筛选对人凝血因子Ⅷ吸附效果较好的新型离子交换树脂,研究其吸附性能。方法将初始浓度为(20±1)IU/ml的冷沉淀提取液,恒温摇床振荡吸附2 h,测定吸附后上清液中蛋白浓度及FⅧ活性,通过蛋白吸附量及FⅧ活性吸附率,获得人FⅧ吸附效果较好的树脂;P-15与A-15树脂相同条件下吸附FⅧ,计算FⅧ的活性吸附率以及蛋白吸附量,考察树脂骨架对吸附的影响,同种方法考察树脂孔径大小对吸附的影响;测定吸附过程中吸附液中蛋白浓度的变化,得到吸附动力学曲线,从而确定吸附速率。分别改变A-15树脂用量、吸附温度、冷沉淀粗提液的pH值以及NaCl浓度,计算FⅧ的活性吸附率以及蛋白吸附量,考察树脂用量、温度、pH值、NaCl浓度对吸附的影响。结果 A-15树脂对FⅧ的活性吸附率为(78.76±4.2)%,蛋白吸附量(77.32±3.8)mg/g;A-15树脂未接基团时对FⅧ的活性吸附率为(12.34±5.6)%,蛋白吸附量为(18.68±5.3)mg/g;随着孔径的增大,树脂对FⅧ的活性吸附率和蛋白吸附量均为先增大后减小;树脂为1.25 g时,即可满足对FⅧ的吸附要求;吸附速率常速为0.003 56 g/mg.min;摇床温度为25～30℃、pH值为6.5～7.0、NaCl浓度为(0.1～0.2)mol/L时为较佳吸附条件。结论 A-15树脂对人凝血因子Ⅷ的吸附效果较好,在较佳吸附条件下,树脂对FⅧ的活性吸附率为78±4%,蛋白吸附量为(77±4)mg/g。     

人凝血因子Ⅷ几种冻干保护剂的比较

目的探讨不同冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品在冻干及干热(100℃,30min)过程中的作用。方法同批次人FⅧ样品在相同冻干条件及一定保护剂(0.3%甘氨酸、1.5%蔗糖、1.0%白蛋白)组成的基础上,改变甘氨酸、蔗糖、白蛋白、木糖醇和精氨酸5种冻干保护剂的含量或种类,组合成6组配方,对不同配方冻干及干热后FⅧ制品外观、复溶后澄清度及FⅧ活性等进行分析比较。结果Ⅰ组(3%甘氨酸):冻干和干热后制品成形最好,但复溶后均有少量絮状物;Ⅱ组(5%蔗糖):冻干和干热后制品均萎缩,冻干过程部分制品水份未抽干,冻干后澄清度较好,干热后部分有少量絮状物;Ⅲ组(2%白蛋白):冻干和干热后制品成形较好,但复溶后均有絮状物;Ⅳ组(5%木糖醇):冻干后制品萎缩,复溶后澄清度最好,干热后膨胀,复溶后有大量絮状物;Ⅴ组(1.2%精氨酸):冻干和干热后制品萎缩,但复溶后澄清度均较好;Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸):冻干后制品膨胀,复溶后澄清度较好,干热后进一步膨胀,复溶有大量絮状物。各组冻干后FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率均较高(≥84.2%);干热后差别明显,其中Ⅲ组(2%白蛋白)FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率最高(≥90.4%),而Ⅳ组(5%木糖醇)和Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸)FⅧ活性≤0.94 IU/ml,回收率极低(≤9.8%)。结论在冻干及干热过程中不同冻干保护剂作用差异较大,甘氨酸赋形作用较好,精氨酸对制品中蛋白稳定作用明显,白蛋白对FⅧ活性保护作用最佳;较高浓度的蔗糖不利于冻干过程中水份的去除,木糖醇不适于作为需100℃干热处理的人FⅧ冻干保护剂。     

S/D法用于人凝血因子Ⅷ病毒灭活效果验证

人凝血因子Ⅷ(FⅧ)浓制剂是用于甲型血友病治疗的血液制品,患者需终身输注.本所用低温乙醇法制备了纯度>3IU/mg蛋白的FⅧ浓制剂,为减少该剂品传播病毒的危害并保证制品的质量,在制作过程中采用了Solvent/detergent (S/D) 法[1]进行病毒灭活.S/D法是由美国纽约血液中心[2]于20世纪8 0年代中期开发的,采用有机溶剂和表面活性剂进行协同处理,用于灭活血浆制品中的脂包膜病毒而不影响蛋白质的性质,已获得美国FDA认可.为验证该方法的效果,笔者对制品在处理前后的活性和理化性质进行了比较,采用HIV、VSV、Sindbis 3个指示病毒对S/D处理人凝血因子Ⅷ进行病毒灭活验证. 1 材料与方法     

两种设备虹吸法制备冷沉淀凝血因子的质量和方法比较

目的通过2种设备(虹吸法)制备冷沉淀凝血因子的质量和方法的比较,选择合适的制备冷沉淀的设备。方法用贝克曼ACL-7000的原厂配套试剂分别对冷沉淀进行凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原的测定。结果血浆融化箱制备冷沉淀中凝血因子Ⅷ含量为80.8-317.9IU,平均值为152.08 IU;纤维蛋白原含量为190.5-759.6 mg,平均值为373.02 mg,全自动冷沉淀制备仪制备冷沉淀中凝血因子Ⅷ的含量为80.2-326.7 IU,平均值为181.3 IU;纤维蛋白原含量为209.1-880.2 mg,平均值为424.8 mg,凝血因子Ⅷ差异有统计学意义(P0.01)纤维蛋白原差异没有统计学意义(P0.05),均达到了国家标准。结论 2种方法都能制备出符合根据《全血及成分血质量要求》规定的冷沉淀,冷沉淀中凝血因子Ⅷ的含量不少于80 IU/袋,纤维蛋白原含量不少于150 mg/袋,但全自动冷沉淀制备仪制备的冷沉淀凝血因子质量及方法优于血浆融化箱法,适宜推广。     

不同制备方法对新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ活性含量的影响

目的 探讨一次成浆与二次成浆法对制备出来的血浆中凝血因子Ⅷ活性含量的影响.方法 对新鲜采集的全血离心分离血浆并在8 h内冻结成块,然后在37℃水浴中复溶后测定两种方法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量.结果 一次成浆法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量为0.70±0.16 IU/ml,二次成浆法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量为0.84±0.16 IU/ml.结论 两种方法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量差异有统计学意义(P＜0.05),二次成浆法比一次成浆法制备出来的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的活性含量要高,值得推广使用.     

MBF21型血浆速冻机对冷沉淀质量的影响

目的探讨原料血浆及冷沉淀冻结时间的长短对制品质量的影响。方法采用血浆速冻机速冻原料血浆和传统低温冰箱直接冻存原料血浆,分别制备冷沉淀,且沿用上述两种方法冻存冷沉淀制品。冷沉淀解冻复融后,检测其中的凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纤维蛋白原(Fbg)含量,对50袋冷沉淀制品的FⅧ、Fbg含量和纤维蛋白絮状物析出的状况进行统计分析。结果应用速冻机速冻原料血浆和冷沉淀制品与应用传统低温冰箱直接冻存原料血浆和冷沉淀制品比较,两者的FⅧ含量、纤维蛋白絮状物的析出,差异有统计学意义(P0.01)。结论实验证明应用速冻机速冻原料血浆和冷沉淀制品,其FⅧ的含量明显高于应用传统低温冰箱直接冻存原料血浆和冷沉淀制品,冷沉淀复融发生纤维蛋白絮状物析出明显减少。速冻的温度和时间是影响FⅧ凝血因子活性及冷沉淀质量的主要因素。     

血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ及蛋白C活性与下肢深静脉血栓形成的相关性

目的通过检测下肢深静脉血栓患者血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ(简称FⅤ、FⅧ或Ⅴ因子、Ⅷ因子)及蛋白C活性,探讨其与患者下肢深静脉血栓形成的相关性及其早期诊断价值。方法随机选取在本院住院的下肢深静脉血栓患者70例,以同期健康体检者70例作为对照组,测定其血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ及蛋白C活性。结果采用Logistic回归分析结果表明,凝血因子Ⅴ、Ⅷ及蛋白C活性是患者发生下肢深静脉血栓的危险性因素。下肢深静脉血栓患者的血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性与健康对照组相比均明显增高,蛋白C活性与健康对照组相比均明显减低,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性与患者下肢深静脉血栓形成有显著相关性,而且血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ、蛋白C活性水平与下肢深静脉血栓形成危险性呈正相关,凝血因子Ⅷ活性异常增高、蛋白C活性降低是下肢深静脉血栓形成的独立危险因素。     

超多人份混合血浆分馏AHF制备FⅧ:C标准品的可行性研究

目的用超多人份混合血浆分馏抗血友病球蛋白(AHF)制备稳定的用于测定凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)的标准品. 方法以WHO第六代FⅧ∶C标准品(WHO-6)和美国国家FⅧ∶C标准品(MEGA-1)为基准,用一期法测定两个批号工作标准品样品的凝血因子Ⅷ促凝活性,并标定其活性值. 结果用WHO-6标定时两批样品的FⅧ∶C(IU/ml)分别为19.14±2.73 和11.75±2.09 ,用MEGA-1标定时两批样品的FⅧ∶C(IU/ml)分别为18.94±3.00和11.63±1.29.同批样品分别用WHO-6和MEGA-1标定时,其促凝活性值的差异无显著性(P＞0.05).将样品置于-30℃条件下保存6个月,用MEGA-1为基准测定,效价未见明显改变. 结论以已知的国际公认FⅧ∶C质控标准品为基准,用本文所推荐的方法可从超多人份混合血浆分馏的AHF中制备数据可靠、性能稳定的FⅧ∶C检测质控和工作标准品,方法具有一定的可行性和实用性.     

人凝血因子Ⅷ制品配方研究

目的摸索一种适用于人凝血因子Ⅷ制品的配方。方法以人凝血因子Ⅷ质量为指标,进行成分筛选实验,对选定的成分再进行剂量选择,获得最终配方、制备成品。进行质量与安全性、稳定性考察,评估最终配方的效果。结果得到的配方效果令人满意,经稳定性(2~8℃、24个月;25℃、24个月;40℃、6个月)考察证明配方稳定有效。结论研发出一种适合人凝血因子Ⅷ制品的配方。     

抗凝血因子ⅧC2区单克隆抗体的制备及功能研究

目的 制备并鉴定抗凝血因子Ⅷ(FⅧ)c2区单克隆抗体(单抗),研究其对FⅧ活性的影响.方法 体外表达rFⅧ C2区蛋白,免疫BALB/c小鼠制备鼠源性单抗.不同剂量的单抗与正常人新鲜混合血浆孵育后测定FⅧ活性及活化部分凝血活酶时间(APTT)等;ELISA法测定该单抗对rhFⅧ与血管性血友病因子(vWF)、磷脂酰丝氨酸(PS)及血小板结合实验的影响.结果 获得一株抗FⅧC2区单抗,命名为SZ-132.与血浆孵育后呈剂量依赖方式抑制FⅧ活性,APTT明显延长;抗体浓度超过25μg/ml时,FⅧ活性为0;该抗体能够抑制rhFⅧ-vWF、rhFⅧ-PS及rhFⅧ与血小板的结合.结论 SZ-132是一株特异性针对FⅧ C2区的抑制性单抗.     

制备冷沉淀的两种方法比较

[目的]对两种不同融化新鲜冰冻血浆制备冷沉淀的方法进行比较。[方法]取40袋新鲜冰冻血浆,分别采用4℃冰箱融化离心法和冰冻血浆解冻箱虹吸法制备冷沉淀,并比较其凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纤维胶原蛋(Fbg)的含量。[结果]4℃冰箱融化离心法和冰冻血浆解冻箱虹吸法FⅧ每袋含量分别为47.6IU±4.1IU、64.2IU±6.0IU,差异有统计学意义(P<0.01),Fbg每袋的含量分别为88.3mg±3.5mg、92.8mg±4.9mg,差异无统计学意义(P>0.05)。前者新鲜冰冻血浆融化平均所需时间约为8.5h,而后者平均所需的时间仅为1h。[结论]两种方法都能制备出符合GB18469-2001《全血及成分血质量要求》的冷沉淀,但冰冻血浆解冻箱虹吸法能制备高质量的冷沉淀,且简便、快速。     

一种全自动血凝仪在人凝血因子Ⅷ浓缩剂效价检测中的应用

目的对STAGO全自动血凝仪检测人凝血因子Ⅷ浓缩剂(FⅧ)效价进行检测方法(一期法)确认。方法使用不同稀释液(样品稀释液(来自2015版中国药典)、Owren-Koller稀释液(来自法国DIAGNOSTICA STAGO公司))检测FⅧ效价,比较二者结果的差异。根据2015版中国药典要求进行检测方法确认,包括准确度、线性和范围、精密度及选择性。结果在(0.125-1)IU/mL范围内,人凝血因子Ⅷ国家标准品(GB)和FⅧ的效价[LOG(IU/mL)]和凝固时间[LOG(S)]均呈线性,相关系数均>0.990,各浓度回算值的回收率为96%-104%;准确度确认中GB回收率100%,各测定值CV≤5.4%;批内和批间精密度结果均CV<10.0%;选择性确认中GB回收率96%,且各效价结果均CV≤5.9%。2种稀释液检测效价结果差值在5%以内。结论 STAGO全自动血凝仪可满足FⅧ效价检测要求;2种稀释液对检测结果无明显差异。     

基于FⅧ探讨不同脱盐方式的效果及对其成分的影响

目的 基于人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)比较5种脱盐方法的脱盐效果及对FⅧ成分的影响,为蛋白脱盐方式提供参考。方法 分别用Sephadex G-25 Medium凝胶、Fractogel EMD BioSEC凝胶、超滤、室温透析和4℃透析5种方法对人FⅧ进行脱盐处理。通过Na⁺、柠檬酸根离子、甘氨酸去除率评估脱盐效果。通过脱盐前后FⅧ蛋白回收率、FⅧ活性(coagulation factorⅧactivity, FⅧ∶C)、VWF抗原(VWF antigen, VWF∶Ag)、VWF活性(VWF activity, VWF∶Ac)、VWF多聚体及SDS-PAGE分析,评估其对FⅧ成分的影响。结果 在脱盐效果方面：Na⁺在超滤脱盐时去除率最低,为(97.90±0.06)%,Fractogel EMD BioSEC凝胶脱盐去除率最高,为(99.82±0.07)%。除Sephadex G-25 Medium凝胶脱盐与Fractoge EMD BioSEC凝胶脱盐间Na⁺去除率无统计学意...     

凯氏定氮法和 Lowry 法测定人凝血因子Ⅷ制剂中蛋白含量的比较

目的：探讨适宜的人凝血因子Ⅷ制剂中蛋白含量测定方法。方法分别应用《中国药典》三部（2010年版）中凯氏定氮法和 Lowry 法测定人凝血因子Ⅷ制剂中的蛋白含量,比较两种方法的稳定性,并以甘氨酸为干扰物质,考察甘氨酸对 Lowry 法的干扰作用。结果两种方法在各自适合的测定范围内,凯氏定氮法的准确度优于Lowry 法,在测定人凝血因子Ⅷ制剂中的蛋白含量时,凯氏定氮法的回收率 RSD 明显高于 Lowry 法。结论Low-ry 法易操作,结果稳定,灵敏度较高,较凯氏定氮法更适合于人凝血因子Ⅷ制剂中的蛋白含量测定。但甘氨酸可干扰 Lowry 法的测定结果,随着甘氨酸含量的增加,干扰作用明显增强。     

人凝血因子Ⅷ活性测定中2种APTT试剂的比较

目的比较进口与自制APTT试剂,在FⅧ∶C检测中的应用.方法人凝血因子Ⅷ活性测定一期法.结果自制APTT试剂在性能上与进口APTT试剂差异无显著性,相关系数(r)均值分别为0.994、0.995;样品重复测定变异系数(CV%)均值为4.22、4.84;样品稳定性CV(%)均值为1.36、1.46.结论自制APTT试剂亦能用于FⅧ制品生产的质量监控以及止血与血栓的研究.     

FⅧ成份和HIV感染对HIV抗体阳性血友病病人的免疫学作用

研究对象为46例HIV抗体阳性的重型血友病甲病人,T4+/T8+均低于1.0。病人随机分为4组,每组只接受一种FⅧ制品。第1组用非热处理中纯FⅧ,第2组(11例)用热处理中纯FⅧ。第3组(12组)和第4组(10例)均使用热处理交换FⅧ制品、1、2组FⅧ特异活性分别为0.6和0.9IU/mg蛋白、纤原分别为总蛋白的50%和36%,Fn为1.5%和40%,IgG为10%和6%,IgM为2%和1.3%。3、4组FⅧ的特异活性分别为2和3.6IU/mg蛋白,Fn为2%和17%,IgM为2.4%和3%,3组FⅧ中纤原为80%,IgG为4%,而4组FⅧ中纤原和IgG几乎没有。第2、3组FⅧ分别经60℃72小时和60℃     

离心法制备冷沉淀凝血因子的影响因素控制

目的 通过对离心法制备冷沉淀凝血因子过程中影响因素的控制,减少凝血因子含量的损失.方法 从2013年7月至2014年6月荆门市红十字中心血站采用严格控制影响因素离心法制备的冷沉淀凝血因子制剂中,采用简单随机抽样方法抽取60袋冷沉淀凝血因子制剂标本作为研究对象,纳入研究组（n=60）;从2012年7月至2013年6月采用一般离心法制备冷沉淀凝血因子制剂中,采用简单随机抽样方法抽取54袋纳入对照组（n=54）.对两组冷沉淀凝血因子制剂中因子Ⅷ（FⅧ）与纤维蛋白原（Fib）含量进行检测.回顾性对比研究组与对照组冷沉淀凝血因子制剂中FⅧ与Fib含量.结果 研究组与对照组的FⅧ含量与Fib含量检测结果均值均为合格.研究组FⅧ含量[（102.8±12.3）IU/袋]显著高于对照组FⅧ含量[（90.4±4.2） IU/袋],差异有统计学意义（t=8.04,P＜0.001）;研究组Fib含量[（179.9±6.7）mg/袋]显著高于对照组Fib含量[（170.2±8.3）mg/袋],差异亦有统计学意义（t=7.72,P＜0.01）.结论 对离心法制备冷沉淀凝血因子过程中影响因素加以严格控制,可减少FⅧ与Fib含量的损失.     

热处理灭活HTLV-Ⅲ/LAV的因子Ⅷ浓缩物的体内与体外评价

作者评价了一种干热处理(68℃,96小时)因子Ⅷ(FⅧ)浓缩物,灭活HTLV-Ⅲ/LAV的方法,对FⅧ和von Willebrand因子(vWf)的影响。此制品为中纯品,含量约25IU FⅧ:C/ml,比活为0.4IU FⅧ:C/mg蛋白。结果:热处理后,一期法和二期法测定FⅧ:C损失的中位数分别为12.3%,9.8%,非加热处理或热处理制品放置24小时后,FⅧ:C无显著损失。FⅧ:Ag值总是     

显色底物分光光度计法测定FⅧ：C新技术的研究进展

用显色底物分光光度计法测定人凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ:C)是70年代末、80年代初发展起来的1种FⅧ:C检测新技术。其基本过程是将混合试剂在Ca~(2-)活化下与因子Ⅷ反应,其生成物与显色底物作用后,测定形成的显色物质的吸光度。显色底物法测定FⅧ:C技术于1976年由Seghatchian等人首创,用于血友病血浆和供血者血浆中因子Ⅷ水平分析。由于使用显色底物进行比色分析。故被称为