牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞体外增殖与向成骨分化的影响

目的观察周期性牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖活性与向成骨分化的影响。方法分离并培养儿童骨髓间充质干细胞，利用体外装置对3～6代细胞加载不同大小的牵张应力，相差显微镜观察细胞形态分布的变化，分别用细胞计数法、四甲基偶氮唑（MTT）和流式细胞仪检测细胞增殖、细胞周期及凋亡情况，同时检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）的活性。结果牵张应力干预MSCs后，细胞形态变长，沿受力环切线方向规则排列，细胞增殖能力增强，细胞周期比例改变，增殖指数增大，细胞凋亡则没有明显差别，ALP、OC的活性显著增强。结论适当的周期性牵张应力可以提高MSCs的增殖能力并促使细胞向成骨分化。     

大鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养和诱导分化

目的 探索从大鼠胚胎肠组织获取肠神经嵴干细胞（neural crest stem cells，NCSCs）的可能性；与脑神经干细胞（neural stem cells，NScs）比较，了解其生物学性状。方法 用NSCs的培养液同时进行肠NCSCs和脑NSCs的培养；得到的神经细胞球用神经上皮干细胞蛋白（nestin）进行鉴定，计数NCSCs神经细胞球和NSCs神经细胞球中各自的Nestin阳性细胞比例。NCSCs神经细胞球在胎牛血清诱导分化培养7d后，用神经元细胞特异性标记神经纤维丝蛋白（NF68）和星形胶质细胞特异性标记神经胶质酸性蛋白（GFAP）对其进行免疫荧光鉴定。结果从大鼠胚胎肠组织成功得到NCSCs，并且形成神经细胞球，Nestin为阳性；分化后细胞为NF68或者GFAP阳性；与NSCs比较，NCSCs能较快形成神经细胞球，其神经细胞球中的Nestin阳性细胞比例（66．75±12．42）％低于NSCs（91．60±5．62）％（P=0．000）。结论 肠NCSCs可以从大鼠胚胎肠组织分离培养得到，在体外培养环境下能够增殖，并且具有多向分化潜能。     

GM1和NGF对神经干细胞体外增殖的影响

目的：探讨单唾液酸神经节苷脂（GM1）、鼠神经生长因子（NGF）对神经干细胞（NSCs）体外增殖的影响。方法：①体外分离培养NSCs;②将含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的NSCs完全培养基及不含bFGF、EGF的DMEM/F12培养基作为两种不同的培养介质,分别加入不同浓度的GM1和NGF,进行NSCs体外增殖研究;③以MTT法和细胞球计数观察NSCs增殖情况;以免疫组化法观察分化条件下药物对NSCs增殖的影响。结果：①在含有bFGF、EGF的NSCs完全培养基中,较高浓度GM1条件下,NSCs增殖明显（P<0.05）;②含血清的分化培养液中,随GM1浓度增加,NSCs增殖明显;随NGF浓度增加,神经元及胶质细胞比例增高。结论：高浓度GM1能促进NSCs增殖, NGF能促进NSCs分化。［中国当代儿科杂志,2009,11（10）：841-845］     

儿茶素拮抗过氧化氢诱导的大鼠内皮祖细胞凋亡

目的：观察过氧化氢（H2O2）对大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPCs）增殖及凋亡的影响及儿茶素对H2O2诱导细胞凋亡的的拮抗作用。方法：免疫荧光法检测EPCs表面标志CD34,CD133和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）的表达;将第2代EPCs分为空白对照组、H2O2组和儿茶素-H2O2组,干预后常规提取DNA琼脂糖电泳观察细胞凋亡梯带的形成;MTT法检测细胞增殖率的变化。结果：①骨髓单个核细胞培养10 d后均表达CD34,VEGFR-2和CD133抗原;②干预1 d后,3组细胞均未出现明显的DNA凋亡梯带;2 d后,H2O2组出现明显细胞凋亡DNA梯带;3 d后,H2O2组和儿茶素- H2O2组均出现明显的细胞凋亡DNA梯带,H2O2组凋亡DNA梯带数量、灰度强于儿茶素-H2O2干预组;③与对照组相比,H2O2组、H2O2-儿茶素组EPCs增殖活性明显下降（P<0.01）;在H2O2组和H2O2-儿茶素组组内EPCs增殖活性第1天和第3天细胞增殖活性明显高于第2天细胞增殖活性（均P<0.05）;H2O2组-儿茶素组细胞增殖活性在3个不同时间点显著高于同一时间点H2O2组细胞增殖活性。结论：H2O2可以降低EPCs增殖活性,诱导其凋亡;儿茶素可以增强EPCs对H2O2 的抵抗力,减少细胞凋亡。［中国当代儿科杂志,2009,11（1）：61-64］     

γ—IFN诱导神经母细胞瘤细胞分化及TrKA表达的实验研究

本实验观察不同浓度的γ－IFN对NB细胞产生增殖抑制及诱导分化作用时,TrkA MRNA表达的变化,及其与增殖抑制,分化程度的关系。首先应用,常规培养SMS－KCNR细胞;然后用三种不同浓度的γ－IFN处理这些细胞,在不同的作用时间,通过台盼蓝拒染实验判定γ－INF对NB细胞的增殖抑制作用及相差显微镜观察NB细胞形态学变化;用RNA－PCR及Southern Blot杂交法检测γ－IFN对NB细胞的Tr-kA mRNA表达的影响。结果表明：（1）1000IU／ml,2000IU/ml,γ-INF对人NB细胞的体外增殖有抑制作用。（2）γ－IFN可诱导NB细胞分化成熟及TrkA mRNA表达水平增高,其作用随时间延长,浓度增加而增强。结论：（1）γ－IFN能够抑制NB细胞增殖并诱导其分化,同时TrkA mRNA表达增加,其作用效应,呈量效依赖关系。（2）TrkA mRNA表达水平的增高可能γ－IFN体外诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一。是     

新生大鼠海马神经干细胞的无血清培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞无血清培养的最佳方法，观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法分离新生24h大鼠的海马组织，分别采用含碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、及bFGF＋EGF的无血清条件培养基进行悬浮培养，采用神经巢蛋白（nestin）免疫荧光染色方法鉴定神经干细胞，通过胎牛血清诱导分化，鉴定分化细胞，进一步证实神经干细胞。结果bFGF＋EGF能更好的诱导神经干细胞增殖，培养细胞呈nestin抗原阳性，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论bFGF＋EGF的无血清培养基可用于培养大鼠海马神经干细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导小鼠脾细胞增殖后趋化因子受体表达的影响

目的：观察小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在体外对小鼠脾细胞表达趋化因子受体的影响。方法：用密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出小鼠骨髓间充质干细胞,经低糖DMEM培养基培养扩增。C57BL/6小鼠脾细胞以1×106/孔的密度接种于24孔板,加入植物血凝素(PHA),培养72 h。实验分3组：A组按10%比例加入MSC;B组按1%比例加入MSC;对照组不加MSC。3 d后收集悬浮的脾细胞进行流式细胞术检测小鼠脾细胞趋化因子受体CXCR3,CCR5,CCR7表达的变化。结果：CD3+CCR5+、CD3+CCR7+在A,B组及对照组中表达的差异均有统计学意义（均P<0.01）;以A组表达率最高,B组次之,对照组最低;CD3+CXCR3+细胞在A组中表达较B组、对照组高（P<0.05）,B组和对照组之间的表达差异无统计学意义。结论：骨髓间充质干细胞在一定浓度下对小鼠脾细胞增殖后趋化因子受体CXCR3,CCR5,CCR7表达有上调作用。［中国当代儿科杂志,2007,9（6）：571-573］     

先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的探讨先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）向心肌样细胞诱导分化的可行性，为心肌组织工程提供新的种子细胞的来源。方法无菌条件下抽取先天性心脏病婴幼儿胸骨骨髓3～5ml，经密度梯度离心（Percoll分离液，T为1．073），接种获得BM～SCs，常规培养。流式细胞仪检测细胞表面抗原。将已传2代的细胞应用5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5Aza）诱导24h，更换为完全培养基（LG-DMEM）后继续培养，2周后行免疫细胞化学及透射电镜行超微结构检查。结果先心病婴幼儿BMSCs基本上为梭型成纤维细胞样形态，表面标记为CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性，CD3、CD14、CD34、CD45、HLA-DR不表达。BMSCs经5-Aza诱导2周后α-actin，Desmin，cTnI，Cx-43免疫细胞化学染色阳性，透射电镜示诱导后的细胞有明显的肌丝，单个细胞核呈椭圆形，位于细胞的中央。结论先心病婴幼儿骨髓阃充质干细胞可在体外经5-Aza诱导分化为心肌样细胞，有望成为应用自体细胞体外构建工程化心肌重要的种子细胞。     

小骨髓间充质干细胞的培养及多向分化潜能的研究

目的研究小儿骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性及多向分化能力,为小儿MSCs的临床应用提供实验依据。方法经Percoll梯度分离接种获得小儿MSCs,观察其形态、排列分布情况,用MTT法检测细胞增殖情况,并绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,诱导剂干预细胞,观察细胞的成骨、成脂肪、成神经等多向分化能力。结果小儿MSCs贴壁容易,呈细长梭形,增殖能力强,融合后旋涡状分布。MSCs分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物（碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节）、脂肪标志物（脂滴、PPARγ-2mRNA）、以及类神经标志物（尼克氏体、NSE、NF-200）有明显的阳性。结论小儿MSCs能稳定增殖、传代,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能,可以作为多方面组织工程的种子细胞。     

免疫性血小板减少症患儿骨髓间充质干细胞与其他来源的间充质干细胞免疫调节作用的比较研究

目的比较免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患儿与正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)及脐带来源间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)的性质及其对正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)的调节能力。方法用密度梯度离心法体外分离培养16例ITP患儿和8例正常成人BMMSCs至5-6代,用酶消化法从10例健康胎儿脐带组织中分离培养UC-MSCs至5-6代。在培养过程中观察三种来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形态,进行细胞表面分子及成脂成骨分化鉴定并用细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测三种MSCs的增殖能力。将上述三种MSCs用丝裂霉素(mitomycin C,MMC)处理后与植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激的PBMC按不同比例(1∶40,3∶40,9∶40)混合培养3 d,收集培养上清液。用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组共培养上清液中IL-10和IFN-γ的含量。结果三种MSCs有相似的细胞形态,UC-MSCs增殖速度最快,正常成人BMMSCs次之,ITP患儿BMMSCs最慢;三种MSCs有相似的分化能力。三种来源MSCs与PBMC以不同比例混合培养,随着MSCs比例的增加,PBMC分泌IL-10增加,在ITP患儿BMMSCs组中不同比例之间差异有显著性(P<0.05),而在正常人BMMSCs、UC-MSCs组中不同比例之间差异有非常显著性(P<0.01);随着MSCs比例的增加,PBMC分泌的IFN-γ减少,在ITP患儿及正常人BMMSCs组中不同比例之间差异有显著性(P<0.05),而在UC-MSCs组中不同比例之间差异有非常显著性(P<0.01)。在相同共培养比例条件下,三种MSCs刺激PBMC分泌IL-10和IFN-γ的量差异均无显著性(P>0.05)。结论 ITP患儿BMMSCs较其他两种来源的MSCs增殖速度慢,说明其体外增殖存在缺陷。但ITP患儿BMMSCs与其他两种来源MSCs对PBMC分泌IL-10、IFN-γ的调节具有相同的特点,即促进IL-10分泌,抑制IFN-γ分泌,均呈剂量依赖性,即三种细胞调节PBMC分泌IL-10及IFN-γ能力未见明显差异。