体细胞基因治疗及其在口腔医学中应用的前景

转基因治疗是近年来引人注目的新领域，发展十分迅速。本文对体细胞转基因的治疗基本概念，技术问题及研究状交进行了论述，同时对基因治疗在口腔医学中应用前景作了综述。     

微囊化转基因技术及与涎腺肿瘤关系密切的抑癌基因

本文综述了微囊化转基因技术及与涎腺肿瘤关系密切的抑癌基因,为微囊化转基因治疗肿瘤奠定了基础。     

唾液腺腺病毒载体转基因研究进展

唾液腺转基因治疗具有创伤小、效率高的特点。腺病毒载体是目前唾液腺转基因研究比较常用的载体之一。本文拟就唾液腺腺病毒载体转基因的应用、转染特点及存在问题作一综述。     

唾液腺腺病毒载体转基因研究进展

唾液腺转基因治疗具有创伤小、效率高的特点。腺病毒载体是目前唾兴腺转基因研究比较常用的载体之一。本文拟就唾液腺病毒载体基因的应用、转染特点及存在问题作一综述。     

转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因拷贝数的检测

目的：采用SYBR Green实时荧光定量 PCR方法检测转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因的拷贝数。方法：用本课题组前期构建的重组质粒pEAC10、pEPC10作为标准品,SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的转基因番茄植株总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数。结果：含pacA-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为1.3,含pacP-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为3.2。结论：构建的转基因番茄植株属低拷贝转基因植物,具有较好的稳定性。     

腭裂相关基因甲状腺转录因子-2转基因小鼠的生物学特征

目的 建立腭裂相关基因甲状腺转录因子-2（TTF-2）转基因小鼠模型,利用转基因动物模型研究TTF-2基因的活动规律和表达模式发生变化时对腭突发育过程产生的影响。方法 采用聚合酶链反应法扩增C57BL/6J小鼠基因组 TTF-2基因,将其定向插入pBROAD3-mcs载体,构建重组表达质粒pBROAD3-TTF-2,利用显微注射技术把线性化表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立TTF-2转基因小鼠。利用特异引物聚合酶链反应和Southern blot方法鉴定转基因小鼠的基因型,采用免疫组织化学法检测TTF-2基因在转基因小鼠腭突组织中的表达。结果 共注射原核期受精卵982枚,发育为2-细胞胚胎的580枚,均移植入48个假孕受体昆明白小鼠中,得到胎鼠 68只。提取基因组DNA,发现有13只转基因阳性的胎鼠。免疫组织化学法检测显示 TTF-2在转基因小鼠腭突中持续表达。结论 通过显微注射法使外源基因pBROAD3-TTF-2整合入小鼠基因组中,成功建立了腭突持续表达 TTF-2的转基因小鼠模型,其表现型为腭裂。     

防龋用转基因番茄生态安全性的评价研究

目的:观察本课题组培育的防龋用转基因番茄中外源目的基因parA-ctxB、pacP-ctxB是否通过花粉和根系分泌物造成基因漂移,初步探讨该转基因番茄防龋疫苗的生态安全性.方法:田间种植转基因番茄,距转基因植株的边缘0.5、1、3、10m处种植非转基因对照番茄作为基因漂移的受体,开花期自由授粉,结果期在距离转基因番茄植...     

牙本质涎蛋白转基因小鼠的建立和转基因表达的初步分析

目的:构建牙本质涎蛋白(DSP)转基因小鼠,并对转基因表达进行初步RT-PCR分析。方法:将pcDNA3.1载体中的CMV启动子替换为启动子cβ-actin,构建载体pcDNA3.1-CX,然后将PCR获得的DSP基因编码序列克隆到pcDNA3.1-CX中,构建DSP转基因载体pcDNA3.1-CX-dsp;将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,将受精卵移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后,用PCR及Southern印迹检测阳性小鼠,并用RT-PCR对其中一小鼠的F1代进行转基因表达分析。结果:共移植717枚注射过的受精卵至29只受体鼠,移卵后产仔67只,阳性4只。检测到53号小鼠F1代外源性DSP的表达。结论:通过显微注射方法,成功获得了DSP转基因小鼠,并证实外源性DSP可在53号小鼠F1代获得表达。     

bFGF及Shh时序传递促进骨再生的实验研究

骨再生的治疗应着重于模拟机体自然的骨修复过程。我们假设在骨再生治疗的早期阶段应用促血管生成因子联合促骨再生因子来模拟自然的骨再生过程能更好更快的促进成骨。首先我们利用腺相关病毒分别携带这两个关键因子,构建了rAAV2-tet-off-bFGF and rAAV2-Shh,前者还加入了四环素调控系统,能通过四环素的添加来控制bFGF的表达。将这两种病毒共感染骨髓间充质干细胞,通过实时定量RT-PCT检测诸如核心结合因子1、碱性磷酸酶及骨钙素等成骨相关的标志因子,同时应用Western blot检测转基因的蛋白表达变化。接着,将这些转基因细胞与β-磷酸三钙颗粒复合,植入到大鼠的标准颅骨缺损中(直径为8mm)。30只SD大鼠平均分为6组,每组5只大鼠。A组植入两种转基因细胞及材料复合物;B组植入rAAV2-tet-off-bFGF转基因细胞及材料复合物;C组植入rAAV2-Shh转基因细胞及材料复合物;D组植入rAAV2-EGFP转基因细胞及材料复合物;E组植入单纯的骨髓间充质干细胞及材料复合物;F组为空白组,不植入任何细胞及材料。术后后5天,除B组外,每日在其它组的动物饮水中添加四环素的衍生物---强力霉素来关闭A组中bFGF的表达,并消除其它对照组的组间差异。术后4周收集颅骨标本,行Micro CT扫描及骨组织形态学分析。结果分析中我们发现,双因子共感染的细胞内成骨相关因子有显著的升高趋势(p<0.05),Micro CT及骨组织切片看见双因子时序调控的治疗组有相当显著的新骨再生,其中新生骨的面积及血管密度显著高于其它对照组,有统计学意义(p<0.05)。因此,我们得出结论,在骨再生初期的治疗过程中引入促血管生成因子及促成骨生成因子的时序协同作用能模拟机体自身的骨再生过程,能显著促进及加快新骨再生。     

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。     

利用转基因植物制备S-IgA

本文介绍了转基因植物的和特点、抗体生产中涉及的问题及植物抗体S-IgA的最新研究进展。 利用转基因植物生产S-IgA具有成本低、安全性高、可大规模生产等特点。在转基因植物表达系统中,用强启动子可提供蛋白的表达水平,用前导序列可引导蛋白进入内质网或植物的其它特定组织,经加工形成多聚体结构。而转基因植物的叶绿体可高效表达外源性蛋白。     

转基因盐藻防龋疫苗的基础研究Ⅱ——两种启动子促进编码嵌合体SBR-CT△A1基因转化盐藻细胞转化效率的比较

目的：比较CaMV35S启动子和Ubil启动子促进编码嵌合体SBR-CT△A1基因转化盐藻细胞的转化效果.方法：采用分子生物学方法构建植物表达质粒pROUSB,采用超声转化法将植物表达质粒pROSB和pROUSB转化盐藻细胞,比较转化效率.PCR法鉴定转基因盐藻.结果：成功构建植物表达质粒pROUSB,超声介导目的基因转化盐藻细胞获得转基因藻落;Ubil启动子可以促进目的基因对盐藻细胞的转化,转化效率高于CaMV35S启动子.结论：Ubil启动子可用于转基因盐藻防龋疫苗的研制,为转基因盐藻防龋疫苗的进一步研究提供了工作基础.     

富组蛋白及其转基因疗法治疗口腔念珠菌病

唾液富组蛋白为小分子的富含组氨酸的多肽,对富组蛋白的结构、功能及基因分析国际上已有20余年的研究历史。本文重点介绍富组蛋白的抗念球菌作用及近年来发展的用富组蛋白转基因疗法预防及治疗口腔念珠菌病的体内外研究现状。     

应用骨组织工程技术修复节段性骨缺损的研究进展

目前临床上治疗节段性骨缺损仍以自体骨移植方式为主,该方法存在一些问题。应用骨组织工程技术修复节段性骨缺损的研究已经广泛开展,从最初的单纯材料修复到细胞复合材料,再到后来的对种子细胞进行转基因修饰,以及对不同种子细胞、不同材料、不同成骨因子的成骨效果进行评估,研究不断深入并显示出了骨组织工程技术应用于修复节段性骨缺损的巨大潜力。     

转基因番茄可食用防龋疫苗免疫BALB/c鼠的实验初探

目的：观察转基因番茄可食用疫苗的免疫原性和免疫反应性。方法：将60只60d龄的雌性BALB／c小鼠随机分为4组，分别口服或腹膜下注射转基因番茄或对照番茄。35d后取小鼠血清样本，用ELISA的方法检测其血清样本中的抗变形链球菌PAc的IgG抗体效价。结果：口服和腹膜下注射转基因番茄组小鼠的血清中均出现了抗PAc的IgG抗体，分别与对照组相比具有统计学差异（P〈0．05），且口服转基因番茄组与注射转基因番茄组的小鼠血清抗体水平无统计学差异（P〉0．05）。结论：转基因番茄所表达的外源蛋白具有抗原性，能够诱导实验动物产生免疫应答。     

变链菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB、p2365-gtfB转化烟草研究

目的获得含变形链球菌葡糖基转移酶编码基因gtfB的转基因烟草植株。方法将携带变形链球菌葡糖基转移酶编码基因gtfB的植物表达载体p2355-gtfB、p2365-gtfB采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化烟草,从而获得抗性烟草植株,并通过GUS染色、npt-Ⅱ基因和部分目的基因片段的PCR扩增对转基因烟草植株进行检测。结果抗性苗经GUS组织染色呈阳性,PCR扩增检测npt-Ⅱ基因及部分目的基因,表明获得了转基因烟草植株。结论目的基因已成功导入烟草基因组中,且具有快速鉴定转化株的优点。     

PLAG1转基因小鼠中差异表达长链非编码RNA的筛选分析

目的 应用基因芯片技术,筛选PLAG1转基因小鼠下颌下区多形性腺瘤中差异表达的长链非编码RNA（LncRNA）。方法 取3对PLAG1转基因小鼠下颌下区多形性腺瘤组织、对侧无瘤腺体组织、空白对照小鼠腺体组织,抽提标本总RNA并反转录合成cDNA探针,与芯片杂交后获得荧光信号, 分析在肿瘤组织中差异表达的长链非编码RNA。随机挑选其中5个LncRNA,利用实时荧光定量PCR在6对样本中验证其表达。采用SPSS13.0软件包中的t检验评价表达差异。结果 基因芯片结果显示,与PLAG1转基因小鼠无瘤腺体组织、空白对照小鼠腺体组织相比,PLAG1转基因小鼠肿瘤中共有5627个LncRNA同时发生差异表达,其中2871个上调、2756个下调。实时荧光定量PCR结果显示,5个随机挑选的LncRNA中,4个（AK146794、ENSMUST00000119440、ENSMUST00000140495、Gm12873）与基因芯片结果一致。结论 应用基因芯片筛选出PLAG1转基因小鼠中差异表达的长链非编码RNA,为进一步研究多形性腺瘤的发病机制提供了依据。     

TNF-α基因转导的Tca8113细胞体外诱导DNL的细胞毒活性

目的:探讨TNF鄄α基因转导的人舌癌Tca8113细胞在体外能否诱导口腔鳞癌的引流区淋巴结细胞(DNL)而提高起其细胞毒活性。方法:体外用逆转录病毒载体将TNF鄄α基因导入Tca8113细胞并进行放射灭活,灭活的转基因细胞与来自舌鳞癌患者的DNL共培养后,采用LDH释放改良法检测诱导后DNL对未转基因Tca8113细胞的杀伤活性。结果:转基因Tca8113细胞诱导的DNL对未转基因Tca8113细胞的杀伤活性高于未经诱导的DNL。结论:TNF鄄α基因修饰的Tca8113细胞能够从肿瘤引流区淋巴结细胞中诱导出高细胞毒活性的免疫活性细胞,诱导出的免疫细胞中可能含有CTL。     

Dlx2条件性激活转基因小鼠模型的建立

目的:建立Dlx2条件性激活转基因小鼠,为实现Dlx2基因在不同组织特异性激活奠定基础.方法:构建Dlx2条件性激活真核表达质粒iZEG-Dlx2并线性化,通过显微注射,获得Dlx2条件性过表达转基因小鼠,应用PCR鉴定其基因型.结果:共获得8只转基因阳性首建鼠,阳性率为11.59％.结论:运用转基因技术,可成功获得Dlx2条件性过表达转基因小鼠,为在体内研究Dlx2基因的功能奠定基础.     

条件性血管瘤转基因小鼠模型的建立

目的：采用条件性转基因策略构建小鼠血管瘤动物模型,并对其表型进行鉴定。方法：构建血管内皮细胞特异性表达启动子Tie2驱动的鼠多瘤病毒中间T基因（ PyMT）表达质粒（ pTie2?PyMT）,采用DNA显微注射方法,将血管内皮特异性表达的PyMT目的基因导入供体C57BL／6J小鼠的雄原核中,再移植到假孕鼠的输卵管中,产生转基因首建鼠。 PCR方法检测目的基因整合情况,检查转基因鼠基因型,观察转基因鼠表型,对于转基因鼠出现的新生物进行组织学及免疫组织化学检测。采用GraphPad Prism 5．0软件包对实验数据进行统计学分析。结果：经测序分析证实,pTie2?PyMT质粒中PyMT、Tie2启动子和Tie2增强子序列等组成元件被正确克隆、连接,且阅读框正确。出生小鼠基因型经PCR鉴定证实,阳性的转基因小鼠均出现血管瘤样新生物表型。血管瘤样新生物主要表达部位在小鼠的耳、舌、皮肤、黏膜、肝等部位,组织学检查证实为血管瘤样病变,免疫组织化学方法证实新生物的内皮细胞表达PyMT蛋白及血管内皮标志物CD31。结论：Tie2启动子驱动下的PyMT基因可以在小鼠体内诱发血管瘤,该模型鼠可用于血管瘤发病机制的研究。条件控制下的转基因技术是一种有效的建立血管瘤动物模型的方法。