变异链球菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB的构建

目的构建含变异链球菌葡糖基转移酶多个免疫显性抗原表位的植物表达质粒p2355-gtfB,为其转化植物研究奠定物质基础,为可食防龋疫苗研究提供条件。方法以真核表达质粒pcDNA3-gtfB为模板,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增含编码变异链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB。将回收纯化的PCR产物经T-A克隆技术克隆于中间载体pMD18-T,双酶切鉴定插入方向后,将目的基因从中间载体释放,再克隆至高效的植物表达载体p2355,用电转化法转化根癌农杆菌EHA105,对重组质粒阳性克隆株进行筛选与鉴定。结果通过对重组质粒T-gtfB进行酶切图谱分析,获得2.9 kb和3.7 kb的2个片断,将重组质粒p2355-gtfB进行酶切、PCR及测序分析,显示p2355-gtfB中插入基因长度为3 675 bp,基因序列与双脱氧链终止法的测定结果相同,证明植物表达质粒p2355-gtfB构建成功,开放阅读框架正确。结论本研究成功构建了含变异链球菌多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因的植物表达质粒p2355-gtfB,为可食性防龋疫苗的研究奠定了基础。     

变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB的构建

目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法:以变形链球菌GS-5全染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增获得含有多个编码变形链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB,将分离纯化的目的基因和质粒pcDNA3用KpnÑ、XhoÑ双酶切,酶切产物在 T4 DNA连接酶作用下进行体外重组,用改良Hanahan法转化感受态大肠杆菌JM109,采用氨苄青霉素抗性LB平板初步筛选阳性克隆子后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定,DNA序列测定。结果:经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3,插入相位正确,未改变目的基因的阅读框架。结论:真核表达质粒 pcDNA3-gtfB含有多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因,且选用的高表达真核表达载体pcDNA3,能直接激活抗原提呈细胞,可以使重组质粒pcDNA3-gtfB具有较强的免疫原性和免疫反应性,为利用其作为基因疫苗防龋奠定了基础。     

重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中的表达

目的:检测含有变形链球菌葡糖基转移酶抗原基因(gtfB)的重组质粒pcDNA3-gtfB能否在哺乳动物细胞 COS-1中正确地转录和表达。方法:采用脂质体介导法,将pcDNA3-gtfB转染哺乳动物细胞COS-1,采用RT-PCR法、免疫组化LSAB法、Western免疫印迹法检测重组质粒的转录水平和表达产物。结果:pcDNA3-gtfB在转染COS-1细胞后具有转录和翻译活性,蛋白质表达产物分子量为116~212 kD,且可与兔抗葡糖基转移酶抗体发生特异性结合。结论:重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中能正确地转录和表达,为其作为基因疫苗进行动物实验提供了依据。     

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。     

变形链球菌葡糖基转移酶gtfB／CAT真核表达质粒的构建及表达

目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶催化区(gtfB/CAT)真核表达质粒(pVAX1-gtfB/CAT),并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达.方法:通过基因重组技术构建pVAX1-gtfB/CAT;通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后以免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达.结果:pVAX1-gtfB/CAT经酶切分析证实携带gtfB/CAT片段;pVAX1-gtfB/CAT转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空质粒转染的细胞胞质中无着色.结论:成功构建防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白.     

GTF-PAc融合防龋DNA疫苗的研究(Ⅰ)携带GLU基因片段的真核表达质粒pGLU的构建

目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ,体外连接 ,构建成真核表达质粒pGLU ,酶切电泳鉴定。 结果 :PCR获得了glu目的片段 ,质粒 pGLU含有 glu目的片段。 结论 :构建出了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒 pGLU     

不同基因型变异链球菌临床分离株的分离和鉴定

目的 分离鉴定变异链球菌临床分离株。方法 收集高龋患者和无龋健康人口腔中牙菌斑标本进行厌氧培养,通过细菌形态学观察、生物化学鉴定、自动微生物分析系统分析、聚合酶链反应（PCR）扩增变异链球菌基因的特异性片段表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（spaP）、葡糖基转移酶B（gtfB）和葡聚糖酶（dexA）以及基因分型等方法对获得的变异 链球菌临床分离株进行鉴定。结果 从32例临床受试者口腔中分离获得46株变异链球菌临床分离株,经生物化学, 自动微生物分析系统,变异链球菌的特异性基因spaP、gtfB和dexA的PCR扩增均鉴定为变异链球菌,基因分型发现 其中5株临床分离株的基因型与其他菌株相同。结论 获得41株不同基因型变异链球菌临床分离株。     

GTF—PAc融合防龋DNA疫苗的研究（Ⅰ）携带GLU基因片的真核表达质粒pGLU的构建

目的：将变形链球菌糖基转移酶GTF－I的编码葡聚糖结合区（GLU）的序列克隆到真核载体pCI中,为构建GTF－PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法：用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒pYNB13的GLU区序;将载体pCl和GLU扩增片段分别酶切,外体连接,构建成真核表达质粒pGLU,酶切电泳鉴定。结果：PCR获得了glu目的的片段,质粒pGLU含有glu目的片段,结论：构建了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒pGLU。     

变形链球菌表面蛋白多肽片段在转基因番茄中的表达

目的在获得含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学的方法检测外源基因在转基因植株中的表达。方法用CTAB法提取子代番茄总DNA,PCR筛选含变形链球菌PAc基因唾液粘附区片段的转基因番茄子代植株;用Trizol提取番茄总RNA,RT- PCR检测外源基因的转录情况;提取番茄果实总蛋白,用Bradford法测定番茄果实总蛋白含量;通过Western blot检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源蛋白含量进行定量测定。结果获得植物细胞染色体上整合有外源基因并发生表达的转基因番茄子代植株;Western blot和ELISA分析表明含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白,该蛋白含量占番茄可溶性总蛋白的1.2%。结论含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。     

在大肠杆菌中表达和提取纯化变形链球菌GTF-Ⅰ

葡糖基转移酶是变形链球菌(S. mutans)的重要致龋毒力因子,其中gtfB基因编码的GTF-Ⅰ能够催化水不溶性葡聚糖的合成,介导变链菌与牙面的蔗糖依赖性粘附,在龋病的发生和发展中起重要作用.目前我们已研制了针对变链菌的表面蛋白PAc和GTF的融合防龋DNA疫苗[1],为了进一步鉴定和加强其免疫效果,我们以金属螯合亲和层析法从大肠杆菌中表达、提取和纯化了重组葡糖基转移酶GTF-Ⅰ.     

变形链球菌表面蛋白和葡糖基转移酶基因疫苗免疫防龋实验研究:唾液和血清抗体水平测定

目的　将基因疫苗pcDNA3-pac和pcDNA3-gtfB经腺周注射免疫定菌大鼠,观察唾液和血清抗体的变化,证实基因疫苗的免疫原性。方法　36只Wistar大鼠分为6个免疫组:pcDNA3-pac,pcDNA3-gtfB,pcDNA3-pac联合 pcDNA3-gtfB,阳性对照灭活变形链球菌,阴性对照pcDNA3及PBS液组。建立龋攻击定菌鼠模型3个月,各组大鼠均以100μg剂量免疫定菌鼠3次,ELISA法检测唾液SIgA和血清IgG水平。结果　疫苗组在首次免疫后第33天 (第5周)都出现较高水平的唾液SIgA,在第75天(第11周)后达最高水平,并持续至实验结束。成组单因素方差分析唾液SIgA水平在总体上各实验组间存在差异(P<0·01或P<0·05),q检验分析在联合免疫组和全菌细胞组最高,单基因疫苗免疫组次之,pcDNA3与PBS组最低;血清IgG水平在4个免疫组之间没有差异(P>0·05),但都高于空白及阴性对照组(P<0·05)。结论　pcDNA3-pac和pcDNA3-gtfB腺周途径免疫定菌Wistar大鼠,能有效诱导唾液 SIgA和血清IgG抗体产生,两种疫苗联合免疫优于单基因疫苗。     

抗龋基因疫苗pcDNA3-gtfB整合宿主细胞基因组DNA的可能性研究

目的　用基因疫苗pcDNA3-gtfB免疫大鼠 ,探讨基因疫苗整合入宿主细胞的可能性。方法　将 36只Wistar大鼠分为两组 ,一组为pcDNA3-gtfB颌下腺免疫组 ,另一组为PBS缓冲液颌下腺对照组。取Wistar大鼠颌下腺、肾脏、肝脏、心脏、肺脏、脑组织 ,以对照组 6种组织基因组DNA为模板 ,加入不同梯度拷贝数的pcDNA3-gtfB ,采用Pyrobest聚合酶PCR反应体系 ,确定PCR反应敏感性。以免疫组 6种组织基因组DNA为模板 ,检测pcDNA3-gtfB的整合率。结果　本实验PCR体系的检测水平为在 1 0 0 0 0个组织细胞核中能检测出一个pcDNA3-gtfB拷贝(1∶1 0 0 0 0 ) ,在此检测水平下 ,免疫组 6种组织基因组DNA中未发现整合。结论　pcDNA3-gtfB整合入宿主细胞基因组DNA的概率不超过 1∶1 0 0 0 0 ,尚未发现抗龋基因疫苗pcDNA3-gtfB整合入宿主细胞基因组DNA的证据。     

变形链球菌防龋基因疫苗pcDNA3-gtfB免疫途径筛选的实验研究

目的:利用含有葡糖基转移酶抗原基因的重组质粒pcDNA3-gtfB作为基因疫苗,筛选有效的免疫途径。方法:重组质粒pcDNA3-gtfB通过股四头肌注射、鼻腔灌注和颌下腺周注射免疫Wistar大鼠,采用ELISA法测定血清 IgG、唾液IgA的动态变化。结果:经股四头肌注射免疫后产生的血清IgG抗体水平明显高于其它两组血清IgG抗体水平(P<0101),且鼻腔灌注组和颌下腺周注射组间的血清IgG抗体水平无显著性差异(P>0105)。各组唾液S-IgA 抗体水平均存在显著差异(P<0101),腺周注射组产生的唾液S-IgA抗体水平最高(P<0101)。结论:基因疫苗通过腺周注射免疫途径能最有效激发特异性唾液S-IgA抗体的产生,可望成为一种有效的防龋基因疫苗免疫途径,为下一步抗龋动物实验提供了实验基础。     

p53 基因敲除 PLAG1 转基因小鼠模型构建的研究

目的：建立p53基因敲除plagl转基因小鼠模型。方法：依托plagl转基因多形性腺瘤小鼠。取两只plagl＋母鼠与一只p53＋／-雄鼠杂交,分别取F1代中基因型为plagl＋p53＋／-的雌雄小鼠交配,得到基因型分别为plagl＋p53-／-,plagl＋p53＋／-及plagl＋p53＋／＋的三种多形性腺瘤小鼠,分别测量比较三种基因型多形性腺瘤的生长速度。结果：plagl＋p53-／-基因型小鼠生长迟缓,寿命短,未能长出肿瘤便已死去。plagl＋p53＋／-肿瘤生长速度较同龄plagl＋p53＋／＋小鼠相比较快,且有明显的差异（P〈O．05）。结论：构建了p53基因敲除plagl转基因小鼠模型,且结果显示p53基因与PLAGl基因的相互作用和多形性腺瘤的生长速度增快有关。     

条件性血管瘤转基因小鼠模型的建立

目的：采用条件性转基因策略构建小鼠血管瘤动物模型,并对其表型进行鉴定。方法：构建血管内皮细胞特异性表达启动子Tie2驱动的鼠多瘤病毒中间T基因（ PyMT）表达质粒（ pTie2?PyMT）,采用DNA显微注射方法,将血管内皮特异性表达的PyMT目的基因导入供体C57BL／6J小鼠的雄原核中,再移植到假孕鼠的输卵管中,产生转基因首建鼠。 PCR方法检测目的基因整合情况,检查转基因鼠基因型,观察转基因鼠表型,对于转基因鼠出现的新生物进行组织学及免疫组织化学检测。采用GraphPad Prism 5．0软件包对实验数据进行统计学分析。结果：经测序分析证实,pTie2?PyMT质粒中PyMT、Tie2启动子和Tie2增强子序列等组成元件被正确克隆、连接,且阅读框正确。出生小鼠基因型经PCR鉴定证实,阳性的转基因小鼠均出现血管瘤样新生物表型。血管瘤样新生物主要表达部位在小鼠的耳、舌、皮肤、黏膜、肝等部位,组织学检查证实为血管瘤样病变,免疫组织化学方法证实新生物的内皮细胞表达PyMT蛋白及血管内皮标志物CD31。结论：Tie2启动子驱动下的PyMT基因可以在小鼠体内诱发血管瘤,该模型鼠可用于血管瘤发病机制的研究。条件控制下的转基因技术是一种有效的建立血管瘤动物模型的方法。     

C‐deletion mutation of the p53 gene at exon 4 of codon 63 in the saliva of oral squamous cell carcinoma in central India: a preliminary study

Aim: The purpose of this study was to detect the C‐deletion mutation of the p53 gene at exon 4 of codon 63 in the saliva of oral squamous cell carcinoma in central India. Methods: The study was carried out in 30 oral squamous cell carcinoma cases and five healthy controls with no habit of betel nut and tobacco chewing. The C‐deletion mutation of the p53 gene at exon 4 of codon 63 was detected in the saliva samples by using polymerase chain reaction. Results: In this study, C‐deletion at exon 4 of codon 63 was detected in 28 of 30 oral squamous cell carcinoma cases (93.33%), but was negative in all five healthy controls and two oral squamous cell carcinoma cases. Conclusions: The results indicated that C‐deletion mutation at exon 4 of codon 63 of the p53 gene in the saliva might be a plausible molecular marker for oral squamous cell carcinoma patients with a habit of betel nut and tobacco lime quid chewing. The results further emphasize the presence of p53 gene mutation in patients with oral squamous cell carcinoma, which can be detected in the saliva through polymerase chain reaction.     

携带变形链球菌表面蛋白、葡聚糖结合蛋白及信号肽基因的真核表达质粒的构建

目的通过构建带有变形链球菌表面蛋白SpaP的P区、葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区（glucan bind-ing domain,GBD）及一段信号肽基因的嵌和体真核表达质粒pSSG,为基因疫苗的制备提供实验基础。方法通过PCR扩增,获得分别编码SpaP的P区和GBD的两个基因片段sp和gg,以及人白介素2信号肽基因（signal）。将它们分别定向插入pMD20-T克隆载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,初步鉴定后测序。将获得的3个基因片段分别双酶切,胶回收纯化后将同样进行双酶切的pVAX1质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,获得真核表达质粒pSSG,并转化DH5α,提取纯化pSSG,进行质粒RCR,酶切电泳鉴定并测序。结果真核表达质粒pSSG构建正确,目的基因sp、gg和signal定向插入至真核表达载体。结论真核表达质粒pSSG包含了SpaP的P区和GBD以及人白介素2信号肽的编码基因,为基因疫苗研究奠定基础。