双重核酸染色法测定皮肤活力的研究

目的 建立一种简便、快速和灵敏的皮肤组织原位活力检测方法。方法 采用活细胞核酸染色剂（SYTO13）和溴化乙啶（EB）2种核酸染色剂对皮肤组织进行双重染色,荧光显微镜下通过颜色不同判断细胞的活力状态并计算出活力百分比。采用一种快速、灵敏的间接活力测定的四氯唑盐法同时对4℃保存不同时间的皮肤进行活力的检测,并将结果进行比较。结果 2种方法测定的结果同时对4℃保存不同时间的皮肤活力的检测,并将结果进行比较。结果 2种方法测定的结果均显示皮肤在一定的保存液中4℃保存后2周时活力为新鲜皮肤的30％左右,2个结果在各时相点均未有明显差异。结论 SYTO／EB测定皮肤的活力快速、灵敏且简便,并可原位观察皮肤内各种细胞的活力,不失为一种可取的皮肤活力检测方法。     

不同冻存-解冻法处理小鼠皮肤组织对毛囊干细胞生长的影响

目的 观察皮肤组织经不同冻存-解冻法处理后,分离的毛囊干细胞的生长状况,寻找较好的组织冻存方案,为解决无法短期收集足量标本而不能有效获取毛囊干细胞的问题提供实验方法参考.方法 获取大鼠有两撮触须的上唇,经不同方法处理后,分离毛囊隆突部细胞.设立对照组:新鲜标本;实验组1:未加冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组2:4℃保存24 h;实验组3:1.4 moL/L.乙二醇作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组4:1.4 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组5:1.4 tool/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存3个月;实验组6:0.7 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;冻存各组降温速率为0.5℃/min.其中3～6组分别采用单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法做对比.比较经以上6种方法处理后分离的毛囊隆突部细胞的活力和贴壁、增殖情况.结果 经冻存+单用培养基漂洗快速复苏法,4℃处理组获得的平均细胞活力为90.38%±4.62%,明显高于其他处理组(P值均＜0.05),仅次于对照组94.00%±5.64%.1.4moL/L DMSO作为冻存保护剂无论冻存24h或3个月均可取得较高的细胞活力(56.00%±3.91%和47.25%±3.55%),明显高于其他处理组(P值均＜0.05).组3～组6经单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法复苏所得平均细胞活力分别是25.63%±2.32%和27.25%±2.56%、56.00%±3.51%和54.88%±4.03%、47.25%±3.01%和44.00%±2.98%、27.88%±2.20%和26.75%±2.26%,差异均不显著(P值均＞0.05).各组毛囊干细胞生物学特性(贴壁、增殖等能力)与细胞活力呈相关趋势.结论 皮肤组织在4℃条件短期内可保持原代培养细胞的活力;皮肤组织以1.4 M DMSO为冻存剂-70℃条件下保存可较长时间保持细胞活力,较适合小鼠皮肤组织的保存,为毛囊干细胞的进一步研究提供技术支持.     

异体脸面复合组织移植供体保存的研究

目的 探讨异体脸面部复合组织移植供体的有效保存方法，以减轻组织缺血缺氧损伤。方法 取狗的脸面部复合组织瓣，分别用4℃生理盐水和UW液灌注、保存，用MTT法检测复合组织瓣取下即刻、保存12、24、48h的各组织的活力，计算其与未保存组织相比的活力百分比，并进行病理学观察。结果 各种组织用UW液保存48h后活力仍为未保存组织的75％以上。保存后24、48h活力百分比与生理盐水组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。病理切片示保存24、48h，生理盐水组皮肤、黏膜组织真皮层纤维排列疏松，轻度水肿，皮肤毛囊周围可见组织玻璃化，毛囊内可见细胞水肿，肌束间间隙扩大，腺体有部分腺泡细胞界限模糊，其他组织未见明显变化；UW液组各组织未见明显组织学变化。结论 UW液可以考虑用于临床异体脸面部复合组织瓣保存的保存液。     

低温保存皮肤纤维连接蛋白和层粘连蛋白的表达

目的:观察细胞外基质中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)在不同温度保存皮肤组织中的分布,以探讨其与皮肤冷冻损伤的关系.方法:用FN、LN抗体对5种保存条件下的皮肤作免疫组化染色,用图像分析仪测定表皮组织中的含量,并用H.E染色观察皮肤的组织结构变化.结果:与新鲜皮片组相比,-196℃H抗冻液中保存皮肤组织结构保存较好,FN、LN含量变化不明显,而4℃、-20℃、-80℃保存皮肤组织结构破坏明显,含量亦明显下降.结论:皮肤低温保存冷冻损伤与细胞外基质中FN、LN破坏有关.     

改良UW液延长低温保存皮片活力的研究

目的 探讨表皮生长因子(EGF)联合改良的UW液对低温保存皮片活力的影响,并探索最佳皮肤保存液.方法 在4℃条件下,将新鲜小猪中厚皮片分别置于UW液以及UW液与3种浓度的EGF和3种浓度地塞米松(DEX)组合所得保存液中保存,于第7d,10d,14d采用氢化碘硝基四唑蓝(INT)法测定皮片活力,并进行皮片病理学和保存液细菌学检查.结果 UW液中加入0.020μg/ml的 EGF和0.048mg/ml的DEX时,14d后皮片活力可高达70%以上,且皮肤组织结构保存最好.此外,各实验组保存液中均未见菌落.结论 4℃储皮条件下,EGF联合改良的UW 液可显著提高皮片活力,有效延长皮片保存时间.     

氚－胸腺嘧啶核苷掺入率对骨髓造血细胞低温保存效果的评价

本研究利用氚－胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入率液体闪烁测定法对骨髓造血细胞低温保存后的活力进行了评价，并对台盼兰拒染率、粒－巨系造血祖细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）培养、３Ｈ－ＴｄＲ掺入率测定三种方法进行了比较，结果表明：３Ｈ－ＴｄＲ掺入率测定直接反应骨髓造血细胞冻存前后的ＤＮＡ合成状态，方法相对较简便，而且敏感性、可靠性高，克服了其他两种方法的局限性，值得推广应用。骨髓造血细胞在不同温度下保存１周，活力相差很大，其中以４℃保存组活力损失最多，而－８０℃和液氮保存组差异不显著（Ｐ＞０．０５），骨髓造血细胞在液氮中保存３０分钟到９０天，各保存组间细胞活力的降低差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明液氮保存骨髓造血细胞，保存时间对细胞活力的影响不大。     

EB病毒感染上调胃癌BGC823细胞的增殖和侵袭能力

目的 探讨EB病毒感染对胃癌细胞增殖状况和侵袭能力的影响。方法 用B95-8细胞体外培养获得EB病毒并感染人胃癌BGC823细胞，MTT法检测细胞增殖状况，羊膜侵袭实验检测细胞侵袭能力，流式细胞技术测定细胞周期变化，RT-PCR法检测感染后胃癌细胞中的病毒基因。结果 EB病毒感染胃癌BGC823细胞后，代表细胞增殖能力的4比值提高34．34％，体外侵袭羊膜的细胞数增加28．72％。S期细胞比例自36．7％增高为41．9％，G0／G1，期细胞比例减少，在EB病毒感染的BGC823细胞中可以检测到EB病毒核抗原1和EB病毒编码RNA1两种病毒基因，未检测到潜伏膜蛋白1和EB病毒核抗原2。结论 EB病毒感染能够促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力、干扰其细胞周期，有可能在胃癌的发生、发展过程中发挥作用。     

组织冷冻损伤对细胞连接作用的影响

目的:了解在无保护剂条件下细胞连接在组织冷冻损伤中的作用.方法:采用细胞单层中可形成细胞连接的MDCK细胞和不形成细胞连接的V79细胞,分为细胞悬液组(Suspension)、贴壁组(Single Tough)和单层细胞组(Monolayer)分别进行0-40℃之间的梯度冷冻实验,然后采用WST-1和MTT两种方法测定细胞的活力并进行比较.结果:两种方法测定的结果一致,均显示两种细胞的细胞悬液冷冻后活力高于贴壁组和单层细胞组;MDCK细胞贴壁组活力高于单层细胞组,V79细胞则无明显差异;MDCK单层细胞组活力却明显低于V79单层细胞组.结论:组织细胞间的连接以及细胞与细胞基质的连接对组织冷冻的损伤有重要的作用,它们的存在直接影响组织细胞的活力,其原因可能与构成细胞连接的细胞骨架系统有关.     

保存温度对移植胰腺功能影响的实验研究

目的探讨保存温度对移植胰腺功能的影响,确定大鼠胰腺的最适保存温度。方法采用原位灌注、单纯低温保存及建立同系大鼠异位全胰十二指肠移植模型,按不同保存温度(0℃、4℃、8℃、12℃)进行分组,保存6h后进行移植,通过光镜观察胰腺组织结构变化,高压液相色谱法检测保存6h后移植物ATP和总腺苷核苷酸(TAN)含量。移植24h后,检测血糖、血清中脂肪酶及淀粉酶含量,测定移植胰腺组织中髓过氧化酶(MPO)活性,并进行组织学观察。结果4℃组保存6h后和移植24h后的胰腺组织结构损伤明显轻于其它组。保存6h后胰腺组织中ATP和TAN水平在4℃组、0℃组、8℃组和12℃组依次降低,差异有显著性意义(P<0.05)。移植24h后血糖、血清脂肪酶及胰腺组织中MPO水平在4℃组、0℃组、8℃组和12℃组依次增高,差异均有显著性意义(P<0.05)。结论4℃对大鼠胰腺是最适保存温度,它能够明显减轻大鼠胰腺的冷损伤程度。     

低温保存对组织工程骨特性影响的实验研究

目的 了解不同低温保存方法对组织工程骨支架生物特性和成骨细胞功能的影响。方法 组织工程骨分别在4℃和-196℃环境下保存3，6个月，以未行保存的组织工程骨和单纯生物衍生骨作为对照。实验分为7组，组织工程骨4℃保存3个月为A3组，保存6个月为A6组，-196℃保存3个月为B3组，保存6个月为B6组，未行保存的组织工程骨为C组，单纯生物衍生骨组为D组，新鲜人体骨为S组（仅作生物力学）。观察细胞的黏附与生长，并行材料的生物力学、碱性磷酸酶活性（ALP）、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率等检查。结果 所有组织工程骨各组均可见成骨细胞在材料表面黏附，细胞在材料孔隙内生长、分化和增殖；材料的力学性能检测显示A3、A6、B3、B6、D组各组间最大载荷比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；A3、A6、B3、B6、D组分别与S组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组成骨细胞ALP活性、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率依次为C组〉B3组〉B6组〉A3组〉A6组。结论 4℃保存方法和-196℃保存方法对生物衍生骨的生物力学性能无明显的影响。4℃保存方法和-196℃保存方法对细胞的存活率和细胞的生物活力有明显的影响，但均能在一定程度上保存细胞的存活率和的细胞的生物活力。-196℃保存方法优于4℃保存方法，但4℃保存方法操作简单、方便和经济。