ELISA法检测猬迭宫绦虫抗体的研究

目的　探讨研制猬迭宫绦虫特异性诊断方法。　方法　将已克隆的编码猬迭宫绦虫幼虫半胱氨酸酶的基因重组到表达载体内 ,制备高纯度的基因工程抗原 ,以此基因工程抗原制成酶联免疫吸附试剂盒 ,检测 6例裂头蚴病患者血清。　结果与结论　基因工程抗原能与裂头蚴病患者血清发生很强的特异性反应 ,而不能与囊虫病患者血清发生反应。此方法的建立为裂头蚴病的特异性诊断奠定了基础。     

湖南省蛇源裂头蚴线粒体nad4和nad5基因遗传多样性分析

目的　了解湖南省蛇源裂头蚴种群遗传多样性及其系统发生关系。方法　采用PCR技术扩增湖南省7株蛇源裂头蚴线粒体nad4基因和nad5基因部分序列（pnad4和pnad5），扩增产物测序后用DNAMAN 7.0、MegAlign、DnaSP 5.0和MEGA 5.0软件进行同源性和系统进化分析。结果　湖南省7株蛇源裂头蚴pnad4和pnad5基因序列长度分别约为578 bp和484 bp，其碱基变异率分别为0～2.8%和0～0.8%；均检测到4个单倍型，总单倍型多样性分别为0.810 ± 0.016和0.905 ± 0.011，核苷酸多样性分别为0.006 ± 0.005和0.004 ± 0.003，平均核苷酸差异为3.960和1.905。构建的系统进化树显示，7株裂头蚴分离株与来自不同地区或不同宿主的猬迭宫绦虫同在一个分支，属于猬迭宫绦虫；与阔节迭宫绦虫相隔较近，与其他绦虫相隔较远。结论　湖南省蛇源猬迭宫绦虫遗传变异程度低，pnad4基因和pnad5基因均可作为检测猬迭宫绦虫的分子遗传标记。     

湖南省蛇源裂头蚴线粒体nad4和nad5基因遗传多样性分析

目的了解湖南省蛇源裂头蚴种群遗传多样性及其系统发生关系。方法采用PCR技术扩增湖南省7株蛇源裂头蚴线粒体nad4基因和nad5基因部分序列(pnad4和pnad5),扩增产物测序后用DNAMAN 7.0、Meg Align、Dna SP 5.0和MEGA 5.0软件进行同源性和系统进化分析。结果湖南省7株蛇源裂头蚴pnad4和pnad5基因序列长度分别约为578 bp和484 bp,其碱基变异率分别为0～2.8%和0～0.8%;均检测到4个单倍型,总单倍型多样性分别为0.810±0.016和0.905±0.011,核苷酸多样性分别为0.006±0.005和0.004±0.003,平均核苷酸差异为3.960和1.905。构建的系统进化树显示,7株裂头蚴分离株与来自不同地区或不同宿主的猬迭宫绦虫同在一个分支,属于猬迭宫绦虫;与阔节迭宫绦虫相隔较近,与其他绦虫相隔较远。结论湖南省蛇源猬迭宫绦虫遗传变异程度低,pnad4基因和pnad5基因均可作为检测猬迭宫绦虫的分子遗传标记。     

曼氏裂头蚴cDNA文库的构建及诊断候选抗原筛选

目的构建曼氏裂头蚴cDNA文库,通过免疫筛选获得曼氏裂头蚴病诊断候选抗原基因。方法提取曼氏裂头蚴虫体总RNA,反转录合成cDNA,连接噬菌体载体,经体外包装后构建曼氏裂头蚴SMART cDNA文库。用曼氏裂头蚴病患者血清免疫筛选cDNA文库,获得阳性克隆,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,进行同源性分析并预测编码蛋白的结构和功能。结果成功构建了曼氏裂头蚴cDNA文库,文库滴度为6.25 × 10~6 pfu/mL,重组率为100%,文库插入片段的平均长度大于1 100 bp。经免疫筛选获得12个阳性克隆,分为Sm-Ⅰ、Sm-Ⅱ、Sm-Ⅲ和Sm-Ⅳ4类,其代表克隆为Sm60-1、Sm58-1、Sm20-1、Sm22-3,插入片段长度分别为1134、1 063、883、969 bp,编码蛋白分别与欧猥迭宫绦虫抗原多肽、胞质抗原、核糖体蛋白S4样蛋白和未命名蛋白具有较高同源性。结论成功构建了曼氏裂头蚴SMART cDNA文库,获得了 4类阳性克隆,为曼氏裂头蚴病诊断抗原的进一步研究奠定了基础。     

曼氏裂头蚴cDNA文库的构建及诊断候选抗原筛选

目的　构建曼氏裂头蚴cDNA文库,通过免疫筛选获得曼氏裂头蚴病诊断候选抗原基因。方法　提取曼氏裂头蚴虫体总RNA,反转录合成cDNA,连接噬菌体载体,经体外包装后构建曼氏裂头蚴SMART cDNA文库。用曼氏裂头蚴病患者血清免疫筛选cDNA文库,获得阳性克隆,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,进行同源性分析并预测编码蛋白的结构和功能。结果　成功构建了曼氏裂头蚴cDNA文库,文库滴度为6.25 × 106 pfu/mL,重组率为100%,文库插入片段的平均长度大于1 100 bp。经免疫筛选获得12个阳性克隆,分为Sm⁃Ⅰ、Sm⁃Ⅱ、Sm⁃Ⅲ和Sm⁃Ⅳ4类,其代表克隆为Sm60⁃1、Sm58⁃1、Sm20⁃1、Sm22⁃3,插入片段长度分别为1 134、1 063、883、969 bp,编码蛋白分别与欧猥迭宫绦虫抗原多肽、胞质抗原、核糖体蛋白S4样蛋白和未命名蛋白具有较高同源性。结论　成功构建了曼氏裂头蚴SMART cDNA文库,获得了4类阳性克隆,为曼氏裂头蚴病诊断抗原的进一步研究奠定了基础。     

人裂头蚴病和无头蚴病：Ⅰ. 病原学的过去和现在

裂头蚴不应误作无头蚴。裂头蚴头节具吸槽或吸槽裂,无头蚴没有头节。裂头蚴是迭宫绦虫的一个发育期,无头蚴是假叶目绦虫一个属的属名。裂头蚴引起良性的裂头蚴病,无头蚴引起恶性的无头蚴病。人裂头蚴病是由迭宫绦虫幼虫引起的,为食源性、水源性、接触源性或亲源性等多种方式传播的人兽共患寄生虫病。近20年来人裂头蚴病和无头蚴病的研究取得较大进展,特别是前者。欧猬迭宫绦虫裂头蚴病和增殖无头蚴病主要分布于东亚,拟曼氏迭宫绦虫裂头蚴病见于美国。迄今全球已记载裂头蚴病患者约1 400例（分布于中国、日本、韩国、美国和泰国等地）,确诊的增殖无头蚴病患者16例（分别于日本、中国、泰国、美国、巴拉圭、委内瑞拉和菲律宾等地）。人是迭宫绦虫裂头蚴的终止宿主,桡足类和蛙为其中间宿主,蛇、猪、鸟和食肉类动物为其转续宿主。无头蚴（绦虫）属的生活史尚不了解。本文综述了人裂头蚴病和无头蚴病的病原学和致病机制的研究进展。待续第二部分将涉及病理学、临床表现、诊断、治疗、流行病学、控制和预防。     

四川与宁夏两地区泡球蚴基因组DNA酶切片段长度多态性的初步分析

本文应用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ完全消化四川、宁夏两地泡球蚴基因组ＤＮＡ，分析其酶切片段长度差异。经ＥｃｏＲⅠ酶切后四川泡球蚴的特有条带为７．９ｋｂ、６．８ｋｂ、５ｋｂ，宁夏泡球蚴的特有条带为８．９ｋｂ和７．１ｋｂ，表明两地泡球蚴重复ＤＮＡ核苷酸序列有明显差异。     

四川与宁夏两地区泡球蚴基因组DNA酶切片段长度多态性的初步分析

本文应用限制制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ｈＩＮＡＤⅢ完全消化四川、宁夏两地泡球蚴基因组ＤＮＡ，在酶切片段长度差异。经ＥｃｏＲＩ酶切后四川泡球蚴的特有条带为７．９ｋｂ、６．８ｋｂ、５ｋｂ，宁夏泡球蚴的特有条带为８．９ｋｂ和７．１ｋｂ，表明两地泡球蚴重复ＤＮＡ核苷酸序列有明显差异。     

初步筛选心血管相关基因——表达序列片段测定法

目的从正常人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库中，用ＤＮＡ自动测序的方法筛选心血管相关基因。方法（１）人胚胎心ｃＤＮＡ文库的构建；（２）挑取有目的基因片段插入的噬菌斑，选用正向Ｔ３和反向Ｔ７引物做ＰＣＲ扩增；（３）直接使用其ＰＣＲ产物做ＤＮＡ测序模板，用荧光标记的Ｔ３Ｂ引物做再次ＰＣＲ扩增；（４）用ＤＮＡ测序仪（ｐｈａｒｍａｃｉａ）测定基因表达序列片段（ＥＳＴｓ）；（５）将所获得的ＥＳＴｓ输入Ｇｅｎｅｂａｎｋ数据库做同源序列分析。结果（１）所构建的人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库的库容量为１×１０９克隆，平均目的基因片段１．２～１．５ｋｂ，ＰＣＲ产物阳性克隆检出率高达７０％以上，用６％尿素－聚丙烯酰胺凝胶电泳５ｈ，可测ｃＤＮＡ序列片段２１０～５５０ｂｐ，平均３００ｂｐ；（２）在所测３１３２个克隆的ＥＳＴｓ中，新ＥＳＴｓ为４７．４％，已知序列片段为４４．１％。结论利用人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库测定ＥＳＴｓ是筛选心血管基因的有效方法；构建高质量的ｃＤＮＡ文库是成功测定ＥＳＴｓ的保证。     

泛种特异性单克隆抗体M26～32的分子生物学特性研究：I.靶抗…

用含ＮＫＮＤ四个氨基酸序列的特异性ＤＮＡ探针筛选恶性疟原虫ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ基因文库，阳性克隆的插入片段经ＰＣＲ扩增，限制性内切酶消化后重组进Ｍ１３噬菌体并进行序列测定和分析，获得６个阳性克隆，其插入片４５０ｂｐ～１．３ｋｂ之间。其中６６１克隆的插入片段的４７７个碱基序列，其一端１２０ｂｐ与探针序列一端完全重叠，表明可合工组成一段含启动子，起始密码子和ＮＫＮＤ四个氨基酸的６７８个碱基的单克隆抗体     

猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析

目的：克隆日本血吸虫中国大陆株20.2kDa分子的编码基因，方法：根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列，设计合成1对引物，通过PCR技术对其最大开放阅读框进行扩增，然后克隆人pGEM-T载体，并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析，利用在线软件推测其编码氨基酸的序列，结果：利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带，大小介于515bp与697bp之间，将此产物克隆入pGEM-T载体，双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段，核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564bp，在线软件分析结果表明，此片段编码187个氨基酸，编码肽段分子量大小约为20．0dDa，结论：本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段，为下一步研究奠定了基础。     

Molecular cloning of newt prolactin (PRL) cDNA: effect of temperature on PRL mRNA expression

A partial prolactin (PRL) cDNA was specifically PCR amplified from a cDNA library constructed from pituitary mRNAs of the newt (Cynops pyrrhogaster) and cloned into plasmid vectors. One clone thus obtained contained a 739-bp insert encoding the C-terminal amino acid sequence of the mature hormone molecule. Using this clone as a probe, the full-length newt PRL cDNA was screened from the cDNA library. The PRL cDNA clone thus obtained consisted of 1024 bp encoding the entire sequence of the mature PRL molecule in addition to its signal peptide. The amino acid sequence of newt PRL deduced from its nucleotide sequence showed higher homologies with those PRL sequences of tetrapod animals than with those of teleosts. Northern blot analysis revealed the newt PRL mRNA size to be approximately 1 kb. In situ hybridization using the newt PRL cDNA as a probe revealed that the pituitary region expressing PRL mRNA corresponded to that immunoreactive with antiserum against PRL. PRL mRNA levels in the pituitary of newts subjected to room and low temperatures were determined by Northern analysis employing the PRL cDNA as a probe. PRL mRNA levels were significantly higher in the pituitaries of newts subjected to 10 degrees than in those of newts kept at 23 degrees. Likewise, immunoassayable plasma PRL levels were higher in animals subjected to 10 degrees than in those kept at 23 degrees.     

旋毛虫成虫期特异性基因的筛选与序列分析

目的　获得旋毛虫成虫期特异性基因序列。方法　应用旋毛虫成虫期特异性探针对成虫cDNA文库进行杂交筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。结果　利用消减杂交 (subtractedhybridization)获得的旋毛虫成虫期特异性探针筛选成虫cDNA文库 ,获得一个长 16 2 9bp的基因。其开放阅读框架由 146 4个核苷酸组成 ,编码 487个氨基酸。序列分析表明 ,该序列是一个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,在 2 0 7～ 2 70位氨基酸间存在两个锌指结构 ,在 5 2～ 6 4,10 8～ 116 ,137～ 16 3,2 2 6～ 2 6 0位氨基酸处存在预测的抗原表位。结论　获得旋毛虫成虫期特异性基因 ,其编码的蛋白具有一定的抗原表位     

一种新的猪囊尾蚴蛋白的cDNA分子筛选、序列分析和克隆

目的免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,为猪囊尾蚴病临床免疫学诊断提供新的候选抗原分子。方法利用脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,测序后与生物信息网站进行分析,并将一个类似血吸虫核糖体蛋白的基因克隆入PMD-18T载体。结果从cDNA文库中筛选出1个编号为5H的基因,长度是528bp;对其编码的氨基酸序列的分析显示其与日本血吸虫的L18a核糖体蛋白具有高度同源性。结论克隆了猪囊尾蚴的未知核糖体蛋白基因。     

Molecular cloning and expression of human myocardial cGMP-inhibited cAMP phosphodiesterase.

We have cloned a cDNA for a myocardial cGMP-inhibited cAMP phosphodiesterase (cGI PDE) from a human heart cDNA library in lambda Zap II. The open reading frame [3.5 kilobases (kb)] of cDNA clone n.13.2 (7.7 kb) encodes a protein of 125 kDa. In Northern blots of total human ventricle RNA, a single mRNA species (8.3 kb) hybridized with a 4-kb EcoRI restriction fragment of clone n.13.2 cDNA (containing the entire open reading frame). The carboxyl-terminal region of the deduced amino acid sequence of the cGI PDE contains the putative catalytic domain conserved among mammalian PDE families. A partial cDNA clone, n.2, encoding a truncated, 54-kDa cGI PDE containing the conserved domain was expressed as a catalytically active fusion protein in Escherichia coli. cAMP hydrolytic activity was inhibited by cGMP and OPC 3911 but not by rolipram. Thus, this report provides direct proof that the conserved domain contains the catalytic core of cGI PDEs.     

Human delta-aminolevulinate dehydratase: nucleotide sequence of a full-length cDNA clone.

Two cDNAs encoding human delta-aminolevulinate dehydratase (ALA-D; porphobilinogen synthase; EC 4.2.1.24), the second enzyme in the heme biosynthetic pathway, were identified, recloned into bacteriophage M13, and sequenced by primer extension. The first clone with an 827-base-pair (bp) pEX-ALA-D cDNA insert, shown to contain DNA sequences that were colinear with four bovine ALA-D peptide sequences, was used to screen a pKT218 human liver library. A second clone containing a 1200-bp insert was identified that contained an open reading frame of 990 bp as well as 5' (66 bp)- and 3' (94 bp)-untranslated regions, the latter terminating in poly(dA). The predicted N-terminal amino acid sequence was colinear with the first 13 residues of microsequenced ALA-D purified from human erythrocytes. The ATG initiation codon was preceded by ACGCC, a functional initiation sequence, while an upstream (position -32), in-phase AACTG ATG sequence was entirely nonhomologous with the initiation consensus sequence and, therefore, presumed to be nonfunctional. The unusual polyadenylylation signal, AGTAAA, has been reported only in the human HRAS1 gene. The nucleotide sequences of the two cDNA clones differed at position 730 or 733 and encoded two differently charged amino acids. This nucleotide difference may be the basis for the polymorphic charge isozymes of human ALA-D. The sequence encoding this zinc metalloenzyme contained a cysteine- and histidine-rich binding site for zinc and an unusual region of charge complementarity surrounding the active lysine residue in the catalytic site.