应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究

目的 对我国猪源旋毛虫地理株进行鉴定和分类。 方法 根据旋毛虫rDNA扩展片段V区（expansion segment V region,ESV）和内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）ITS1和ITS2基因序列合成5对特异性引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T. nativa,T2）、布氏旋毛虫（T. britovi,T3）、伪旋毛虫（T. pseudospiralis,T4）及纳氏旋毛虫（T. nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用多重PCR对我国6个猪源旋毛虫地理株（河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津）进行鉴定,并观察影响多重PCR扩增的因素。 结果 我国6个猪源旋毛虫地理株多重PCR扩增结果显示,均具1条与T1相同的条带（173 bp）。应用多重PCR对单条旋毛虫幼虫、不同保存条件的旋毛虫幼虫及含幼虫的新鲜小鼠肌肉提取液进行扩增,均得到173 bp的特异性条带。 结论 经多重PCR鉴定我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。     

我国旋毛虫地理株的同工酶分析

目的 为旋毛虫属的分类提供依据.方法 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对我国6个猪源旋毛虫地理株(河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津)肌幼虫的超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸酶(ME)、酯酶(EST)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)进行分析,并以旋毛虫(17tichinella spiralis,T1)、乡土旋毛虫(T. nativa,T2)、布氏旋毛虫(T. britovi,T3)、伪旋毛虫(T. pseudlospiralis,T4)及纳氏旋毛虫(T. nelsoi,T7)的国际参考株作为对照.结果 我国6个猪源旋毛虫地理株的4种同工酶(SOD、ME、EST、GLDH)酶谱均与T1的相同.结论 经4种同T酶分析我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1.     

应用COXⅠ基因PCR-RFLP对我国旋毛虫地理株的鉴定

目的对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定。方法根据旋毛虫线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochromec-oxidase subunitⅠ,COXⅠ）基因序列合成1对引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T.nativa,T2）、布氏旋毛虫（T.britovi,T3）、伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）、纳氏旋毛虫（T.nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP）技术对我国7个猪源旋毛虫地理株（河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津株）进行分子鉴定。结果T1、T2、T3、T4、T7和我国7个猪源旋毛虫地理株的COXⅠ基因均扩增出419 bp的片段,PCR扩增产物Tru1Ⅰ（MseⅠ）酶切后经RFLP分析,T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型：T2为22、70和327 bp,T3为92和327 bp,T4为419 bp,T7为62、64、70和223 bp,天津株为92、126和201 bp;其他6个地理株的酶切带型和T1一致,为22、70、126和201 bp。结论我国7个旋毛虫地理株的COXⅠ基因片段（92、70和22 bp）存在种内多态性;河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类。     

Ts21基因在旋毛虫不同期虫体的表达及特性的研究

目的观察旋毛虫Ts21基因在不同发育期虫体的表达及其特性。方法应用RT-PCR检测旋毛虫Ts21基因在成虫、新生幼虫、感染后15d的成囊前幼虫及感染后42d的成囊幼虫(肌幼虫)的转录情况;应用抗Ts21重组蛋白血清通过间接荧光抗体试验(IFA)对成囊前幼虫及肌幼虫冰冻切片抗原进行检测。应用抗Ts21重组蛋白血清对旋毛虫肌幼虫粗(可溶性)抗原及排泄分泌(ES)抗原进行Western-blot分析。结果RT-PCR发现旋毛虫成虫与感染后42d肌幼虫均扩增出一条分子量约540bp的特异性条带(Ts21基因目的条带),而新生幼虫与感染后15d成囊前幼虫则未扩增出目的条带;IFA结果表明抗Ts21重组蛋白血清只与感染后42d成囊幼虫抗原发生阳性反应,而不与感染后15d的成囊前幼虫抗原发生阳性反应。Western-blot结果显示抗Ts21重组蛋白血清只与旋毛虫肌幼虫粗抗原和ES抗原中Mr 21 000的单一蛋白条带发生阳性反应。结论旋毛虫Ts21基因的表达具有期特异性,Ts21蛋白是旋毛虫肌幼虫ES抗原中的一部分。     

旋毛虫部分抗原表位的识别与分析

[目的 ]筛选旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中具有免疫显性的表位。 [方法 ]采用杂交瘤技术 ,获得 15株特异性单克隆抗体 ,随后用酶联免疫吸附试验 (ELISA)、免疫印迹法 (Westernblotting)和间接免疫荧光试验(IFA)对部分免疫显性抗原进行分析。 [结果 ]Westernblotting试验显示 ,6株单抗与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原反应显示有特异条带 ,分子量为 40～ 70kDa ;而多抗血清则可识别 2 0～ 2 0 0kDa之间 10条条带。IFA可观察到 ,6株单抗中有 4株单抗的靶抗原定位在旋毛虫肌幼虫表皮层上 ,另 2株定位于杆状体 (stichosome)及表皮层。 [结论 ]识别与分析部分旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中具有免疫显性的表位 ,为纯化旋毛虫的抗原及疫苗靶抗原的研制提供了有价值的实验依据。     

PCR检测鉴别我国5个旋毛虫地域株的研究

为明确我国不同地域株旋毛虫分子分类概况，采用扩增长度片断多态性（AFLP）对来源于云南、湖北、西安、天津、黑龙江5个地区的旋毛虫株作PCR研究。使用引物为P1株旋毛虫1．6kbDNA重复序列，质粒pPRA设计的A1、B1，模板DNA酚、氯仿、异成醇抽提和粗提DNA两种，经反复多次扩增，1．5％琼脂糖凝胶电泳。5个地域株均获得稳定的500hP条带，湖北与天津株还获得非稳定的670hP条带。与国外文献报道比较，中国大陆各地域株旋毛虫与欧洲各株旋毛虫有明显差异，与香港株相近。大陆各地的地域株之间差异不明显，仅见湖北、天津株与其它3个地域株有不稳定的差异。     

聚合酶链反应技术检测旋毛虫DNA的实验研究

目　的　建立敏感、特异、稳定的聚合酶链反应 (PCR)法 ,以检测旋毛虫病。方法　采用PCR法 ,选择与合成引物并确立最佳扩增条件 ,比较不同的提取DNA方法 ,检测血浆中旋毛虫幼虫。结果　经扩增于 5 0 0bp、6 70bp、12 0 0bp出现特异性片段 ,与原选择的编码基因片段大小相同 ,此特异片段与溶组织内阿米巴、日本血吸虫DNA无交叉反应 ,不同的DNA提取法结果显示 :用裂解煮沸法同样可从仅含 1条旋毛虫幼虫的 2 5 μl正常小鼠血浆中扩增出特异性片段。 结论　PCR法检测旋毛虫敏感高、特异强 ,提示本法可进一步用于人与畜旋毛虫感染的早期诊断与监测     

我国首次发现乡土旋毛虫的研究报告

目的 :对我国两株旋毛虫进行虫种归属鉴定。方法 :通过生物学特性的比较研究。结果 :单对虫体杂交试验 ,表明河南猪株与黑龙江犬株存在生殖隔离现象 ;冷冻耐力试验 ,在 - 15℃下 ,前者 9d即死亡 ,后者可存活 1年以上 ;在 4℃ ,前者肌肉期幼虫呈圆盘状卷曲 ,后者呈螺旋状卷曲 ;生殖力指数 ( RCI)在小鼠试验分别为 195.7和 6.2 ( P<0 .0 1) ,在大鼠分别为 191.3和 14.4 ( P<0 .0 1) ;前者对家猪易感 ,后者不易感 ;随机扩增多态性 DNA指纹分析其扩增后产物的 DNA片段电泳带型 ,河南猪株旋毛虫与 T.spiralis基本相同 ,黑龙江犬株旋毛虫与 T.nativa一致。结论 :我国至少存在上述两种旋毛虫 ,即 :河南猪株旋毛虫系 T.spiralis,黑龙江犬株旋毛虫系 T.nativa。     

应用PCR检测旋毛虫DNA的研究

根据旋毛虫幼虫１．６ｋｂ基因序列而设计合成引物，并进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）以检测含鼠肌肉旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出了特异的６７０ｂｐ与５００ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，而正常肌肉对照未见扩增出此条带。本法可检测０．０１条幼虫产物，具有高敏感性和特异性     

四个旋毛虫地理株肌幼虫虫体抗原和排泄—分泌抗原的免疫学分析

目的分析4个旋毛虫地理株肌幼虫的虫体抗原、排泄-分泌抗原的蛋白组成和免疫学特性。方法昆明小鼠16只,每只感染旋毛虫肌幼虫300条,45 d后人工消化法收集旋毛虫肌幼虫制备虫体抗原,幼虫体外培养获得排泄-分泌抗原。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分析虫体抗原和排泄-分泌抗原的组分,并用感染小鼠血清和旋毛虫病、血吸虫病、华支睾吸虫病、棘球蚴虫病、裂头蚴病、鞭虫病、卫氏并殖吸虫病、囊尾蚴病、钩虫病患者血清与抗原进行免疫印迹反应,观察阳性反应抗原条带。结果经SDS-PAGE分析,4个旋毛虫地理株虫体可溶性抗原和排泄-分泌抗原均有8条主带,相对分子质量(M_r)分别为100000、66000、49000、45000、43000、30000、18000、12000和M_r 66000、53000、49000、43000、36000、34000、30000、16000。免疫印迹结果显示,旋毛虫肌幼虫虫体可溶性抗原与旋毛虫病患者和感染小鼠血清的反应条带以M_r 95000、72000、53 000、49 000、43 000为主,排泄-分泌抗原反应条带以M_r 53 000、49 000、43 000、40 000为主。结论各地理株不同抗原的组分和免疫学反应存在一定的差异,其中虫体可溶性抗原的M_r 95 000、72 000成分和排泄-分泌抗原的M_r 40 000成分是进一步研究的重点。     

用分子生物学技术分析国内六株旋毛虫分离株

本文首次对来自我国不同地区、不同宿主来源有代表性的6个旋毛虫分离株从基因组DNA的限制性酸切长度多态性、同工酶及可溶性蛋白进行综合研究。核酸结果显示：长春株与其余各地域株的限制性酶切困话间存在着差异，用长春株特异性DNA片段（1．12kb）制成探针，与各株DNA进行Southern杂交，发现各虫株的杂交带型不一，且仅长春株出现1．12kb杂交带。同工酶结果显示：长春株与其余各珠在5种同工酶（GPI、G6PD、HK、6PGDH及AK）酶谱中有显著不同。等电聚焦电泳结果显示：长春株具有一条约4.1PI的特异带。上述结果提示：我国6株旋毛虫分离株间存在着差异，长春株与其余各株差异显著，从而推断我国旅毛虫虫株至少存在2种不同的生物学类型，其间的差异主要与不同的地理分布和／或不同宿主来源有关。     

广西两地旋毛虫分离株5S rDNA序列分析

目的 应用5S rDNA序列分析，鉴定广西德保、南丹两地旋毛虫分离株。 方法 PCR扩增2个分离株5S rDNA片段，并对扩增产物进行测序；用相关软件分析序列的同源性、遗传距离，同时构建系统发生树，并与GenBank中旋毛虫相应基因序列进行比较。 结果 广西德保、南丹2地旋毛虫分离株和GenBank中Trichinella spiralis的5S rDNA碱基序列长度相同，为695 bp；变异位点4个，与T. spiralis的相似度分别为99.0%和99.1%，与GenBank中其他相应基因的相似度低于94.2%，2个分离株之间的相似度为98.8%。2个分离株之间及与T. spiralis间的遗传距离最小，均为0.014；而与其他旋毛虫的遗传距离均大于0.056；用邻接法（N-J法）和最大简约法（MP法）构建的2个系统发生树中，2个分离株与T.spiralis位于同一分支，自引导值分别为96及99。 结论 初步鉴定广西德保和南丹旋毛虫分离株均为T.spiralis。     

伊维菌素和丙硫咪唑对小鼠旋毛虫病的疗效试验

目的　为伊维菌素更广泛临床应用提供科学依据。方法　用伊维菌素和丙硫咪唑对人工感染旋毛虫各隔离种的小鼠进行疗效试验 ,观察其杀虫效果。结果　 30mg/kg·d的丙硫咪唑对猪旋毛虫、旋毛形线虫 (Trichinellaspiralis)、犬旋毛虫和本地毛形线虫 (Trichinellanativa)的 3个时期虫体均有 10 0 %的杀虫效果。 0 3mg/kg·d的伊维菌素对 4个旋毛虫隔离种的移行幼虫和包囊幼虫杀虫效果较好 ,杀虫率分别为 75 97%～ 89 6 3%和 71 95 %～ 82 81% ,而对成虫较差 ;该药对犬旋毛虫和本地毛形线虫的杀虫率比猪旋毛虫和旋毛形线虫要高些。结论　试验揭示伊维菌素对旋毛虫没有高效的杀灭作用     

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　观察编码旋毛虫相对分子质量(Mr)31000抗原的DNA疫苗(重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。　方法　通过用阳离子脂质体Lipofectamine2000将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞,G418筛选阳性克隆,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、间接荧光抗体试验(IFAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)对表达产物进行鉴定。　结果　RT PCR结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在876bp处有一条带,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约31000的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。　结论　重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫     

我国旋毛虫地理株遗传变异与系统发生关系的研究

目的通过分析旋毛虫线粒体基因分子标记,研究我国旋毛虫地理株间的遗传变异与系统发生关系。方法应用旋毛虫线粒体核糖体小亚基DNA（mitochondrial small subunit ribosomal DNA,mtSSU）和线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因（mitochondria cytochrome coxidase,COΙ）为分子标记,分别对我国7个旋毛虫地理株扩增后进行双向测序,利用DNAMAN软件将测序结果和GenBank中相应序列进行比对研究,并使用MEGA4.0程序包构建系统进化树。结果 PCR对7个旋毛虫地理株分别扩增出了649bp（mtSSU）和419bp（COΙ）的DNA片段,7个地理株的DNA片段与GenBank中T.spiralis的相应片段相比存在一定差异,其中mtSSU基因有4个变异位点（248、293、537和539位）,而COI基因仅存在2个变异（273和382位）,所有变异均为T-C或C-T的转换;进化树显示南阳株和云南株位于比较近的分枝,而西安株、广西株及西藏株亲缘关系较近。结论我国7个旋毛虫地理株的遗传变异较小,亲缘关系较近。     

Wild and domestic animals as permanent Trichinella reservoir in Poland

BACKGROUND: [corrected] Since Owen first described Trichinella as a human patogen in 1835, the number of organisms comprising this genus has grown dramatically. This etiological agent of human trichinellosis shows worldwide distribution in domestic and/or sylvatic animals. MATERIAL AND METHOD: The aim of the presented paper was to determine the distribution of Trichinella species in wild animals such as red foxes, wolves, wild boars, and domestic pigs in Poland. Muscle samples from diaphragm and forelegs were collected from animals killed by hunters. Muscle larvae were recovered from the muscle after artificial digestion and identified at the species level by RAPD, PCR-RPLF and multiplex PCR. RESULTS: Of 75 nematode isolates from red foxes: (Vulpes vulpes), 50 resulted as T. britovi, 6 T. spiralis, 6 were mixed infections of these two species. Fifteen Trichinella isolates remained unidentified. Of 97 nematode isolates from wild boars (Sus scrofa), 21 resulted as T. britovi, 69 T. spiralis, 2 were mixed infections of these two species. Five Trichinella isolates remained unidentified. Of 6 examined wolves (Canis lupus) killed in the Bieszczady region, 3 animals were positive against T. britovi. Of 6 examined raccon dogs (Nyctereutes procyonoides) from Pomorskie region, 2 animals were positive against T. spiralis. Of 21 nematode isolates from domestic pigs, 1 resulted as T. britovi and 21 as T. spiralis. Up to date, two Trichinella species are detected as the etiological agents of epidemiology among domestic and wildlife animal in Poland: T. britovi is the dominant species in red foxes and T. spiralis is the dominant species in wild boars and domestic pigs.     

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的　对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法　采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果　T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论　中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3、T7分为另两大类