化痰消瘀方通过调节自噬对大鼠癌前病的改善作用

目的探究化痰消瘀方通过调节自噬对大鼠癌前病的改善作用。方法构建大鼠PLGC模型,将大鼠随机分为对照组、模型组、胃复春组(0.5 g/kg)及化痰消瘀方低、高剂量组(5、10 g/kg),灌胃给药4个月。记录大鼠在治疗过程的生存状况、体质量;HE染色观察胃窦部组织病理状态,免疫组化、Western blot及RT-PCR检测LC3、Raptor、Beclin-1蛋白及mRNA表达。结果与模型组比较,化痰消瘀方提高PLGC大鼠体质量(P0.05),抑制PLGC大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1蛋白及mRNA表达(P0.05),以上三者蛋白均在细胞核或细胞中表达,化痰消瘀方能改善PLGC大鼠胃窦部组织病理状态。结论化痰消瘀方能改善PLGC大鼠胃窦部组织病理状态,其可能机理在于降低胃组织LC3、Raptor、Beclin-1自噬相关蛋白及mRNA表达。     

化痰消瘀方治疗胃癌前病变的分子机制研究

目的:基于网络药理学预测和胃癌前病变(PLGC)大鼠模型验证的方法,探讨化痰消瘀方治疗胃癌前病变的分子机制。方法:利用网络药理学技术筛选化痰消瘀方治疗胃癌前病变的关键活性成分及其作用靶点,并进行蛋白质间相互作用分析,GO功能富集和KEGG通路富集。建立PLGC大鼠模型,给予化痰消瘀方干预治疗12 w,苏木精-伊红染色法观察大鼠胃黏膜组织的病理学改变,AB-PAS染色法观察大鼠胃黏膜组织的肠上皮化生病理改变,免疫组化法对预测结果中PI3K/Akt信号通路的相关蛋白表达进行分析。结果:网络药理学结果显示:化痰消瘀方含有98个活性成分,作用于129个靶点,主要涉及酶结合、药物反应、细胞凋亡调控等生物学途径以及PI3K/Akt、TNF等信号通路。动物实验验证结果显示:与模型对照组比较,化痰消瘀方干预治疗后可改善PLGC大鼠胃黏膜组织病理学改变,并减轻肠上皮化生等病理改变,PI3K/Akt信号通路中相关蛋白p-Akt、p-PI3K、mTOR表达下调,PTEN表达上调。结论:化痰消瘀方通过多成分、多靶点、多通路共同作用治疗PLGC,其中PI3K/Akt信号通路是其作用的主要通路之一。     

川陈皮素防治肝缺血再灌注损伤的作用机制研究

目的探究川陈皮素防治肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)的作用及机制。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组和川陈皮素(10 mg/kg)组,采用ELISA法检测各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性;采用苏木素-伊红(HE)染色法考察各组大鼠肝组织病理变化;采用透射电子显微镜(TEM)观察各组大鼠肝细胞线粒体结构;采用Western blotting和qRT-PCR考察各组大鼠肝组织自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、自噬相关基因-7 (autophagy-related gene-7,ATG-7)、p62蛋白和mRNA表达情况。采用H2O2诱导大鼠肝细胞BRL建立氧化损伤细胞模型,设置对照组、模型组和川陈皮素(10μmol/L)组,采用Western blotting和qRT-PCR考察各组细胞Beclinl、LC3-Ⅱ、ATG-7、p62蛋白和mRNA表达情况;采用MitoTracker染色和免疫荧光法考察各组细胞自噬蛋白与线粒体的共定位情况;考察自噬抑制剂和诱导剂对川陈皮素细胞保护作用的影响。结果与对照组比较,模型组大鼠血清ALT和AST活性均显著升高(P0.05),肝组织病变,肝细胞线粒体数目增加,结构错乱,受损的线粒体被吞噬,肝组织中LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05);与模型组比较,川陈皮素组大鼠血清ALT和AST活性明显降低(P0.05),肝组织病变程度减轻,线粒体形态变化得到明显改善,肝组织中LC3-Ⅱ、Beclinl、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05)。氧化损伤细胞模型中BRL细胞LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),Beclin1和MitoTracker的共定位数目增加;与模型组比较,川陈皮素组BRL细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),Beclin1和MitoTracker的共定位数目减少;自噬抑制剂3-MA (1、5 mmol/L)显著增强川陈皮素对BRL细胞的保护作用(P0.05),自噬诱导剂雷帕霉素显著抑制川陈皮素对BRL细胞Beclin1蛋白和mRNA表达水平的下调作用(P0.05)。结论川陈皮素对HIRI具有较好的防治作用,其机制可能与抑制线粒体自噬有关。     

龟羚帕安丸对帕金森病大鼠中脑黑质病理、Beclin1、P62及LC3Ⅱ影响的研究

目的观察龟羚帕安丸对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠模型中脑黑质神经细胞病理及自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3Ⅱ表达的影响。方法采用6-羟基多巴(6-OHDA)注射法建立PD大鼠模型,造模成功大鼠随机分为模型对照组、美多芭组、龟羚帕安丸高、中、低剂量组及假手术对照组,每组10只。对照组、模型组给予等容积生理盐水,其余组给予相应药物灌胃,连续给药30 d。观察各组大鼠中脑黑质病理改变;免疫组化法检测大鼠中脑黑质Beclin1、P62及LC3Ⅱ蛋白的表达变化情况。结果模型组神经元细胞出现较为明显的损伤;模型组中脑黑质Beclin1及LC3Ⅱ表达降低,P62表达明显升高;各治疗组大鼠神经元损伤情况较模型组有所改善,中脑黑质Beclin1及LC3Ⅱ表达明显升高,P62表达明显降低。结论龟羚帕安丸可明显改善神经细胞损伤,作用机制与提高Beclin1及LC3Ⅱ表达,降低P62的蓄积,疏通自噬-溶酶体降解途径,提高细胞自噬活性,改善细胞自身稳态有关。     

化痰消瘀方对胃癌前病变大鼠bcl-2、bax、mTOR及LKB1表达的影响

目的观察化痰消瘀方对胃癌前病变大鼠胃黏膜bcl-2、bax、mTOR、LKB1表达的影响。方法将100只大鼠随机分为正常组17只和造模组83只。正常组给予正常饮食,造模组采用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)联合饥饱失常法造模。将造模成功大鼠随机分为模型组、化痰消瘀低剂量组、化痰消瘀中剂量组、化痰消瘀高剂量组和维霉素组。正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃,各给药组分别给予相应药物灌胃,1次/d,连续12周。37周末处死所有大鼠,取胃窦及胃体组织,镜下观察各组大鼠胃黏膜组织病理变化,计算胃癌前病变发生率;免疫组化法检测胃黏膜组织中bcl-2、bax、mTOR、LKB1蛋白表达情况。结果模型组胃癌前病变发生率为84.6%,各给药组胃癌前病变发生率均明显低于模型组(P均<0.05)。模型组大鼠bcl-2、mTOR蛋白表达水平明显高于正常组(P均<0.05),bax、LKB1蛋白表达水平明显低于正常组(P均<0.05)。各给药组bcl-2、mTOR蛋白表达水平明显低于模型组(P均<0.05),且化痰消瘀方中高剂量组明显低于维霉素组(P均<0.05);各给药组bax、LKB1蛋白表达水平明显高于模型组(P均<0.05),但化痰消瘀方低、中、高剂量组与维霉素组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论化痰消瘀方可逆转胃癌前病变的发生,作用机制可能与其能下调bcl-2、mTOR蛋白的表达,上调bax、LKB1蛋白的表达有关。     

当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠自噬蛋白LC3，Beclin1，p62表达的影响

目的:研究当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠的防治作用及对自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3),自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),p62表达的影响。方法:将6周龄SD雄性大鼠随机分为正常组,风湿热痹模型组,当归拈痛汤低、中、高剂量组(5.67,11.34,22.68 g·kg^-1),甲氨蝶呤(MTX)组(1.35 mg·kg^-1),每组10只,通过对大鼠尾根部皮下注射灭活结核分支杆菌佐剂建立佐剂性关节炎大鼠模型,用人工气候箱进行风湿热痹证模型造模16 d,于免疫当天灌胃给药,持续28 d。进行大鼠一般情况观察及足趾肿胀度、关节炎指数(AI)检测,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠膝关节滑膜组织病理形态学改变,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠滑膜组织LC3,Beclin1,p62的mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫组化法分别检测大鼠滑膜组织LC3,Beclin1,p62的蛋白表达。结果:与正常组比较,风湿热痹模型组大鼠给药16,20,24,28 d时足趾肿胀度显著升高(P<0.01),AI显著升高(P<0.01),滑膜细胞增生显著,自噬蛋白LC3,Beclin1蛋白及mRNA表达显著上调(P<0.01),p62蛋白及mRNA表达显著下调(P<0.01);与风湿热痹模型组比较,各给药组大鼠足趾肿胀度减轻,滑膜增生情况有不同程度改善,LC3,Beclin1的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01),p62的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),且当归拈痛汤中剂量组防治效果最佳。结论:当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠有明显的防治作用,且这种防治作用可能与调控滑膜组织中自噬相关因子LC3,Beclin1,p62的表达,抑制自噬有关。     

筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经Beclin1和LC3的影响

目的探讨筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经组织自噬相关蛋白Beclin1和LC3的影响。方法 STZ诱导建立糖尿病大鼠模型,随机分为正常对照(NC)组、糖尿病模型(DM)组和筋脉通治疗(JMT)组。灌胃治疗16周后,Western blot法检测Beclin1、LC3蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测Beclin1-mRNA和LC3-mRNA的转录。结果与NC组比较,DM组大鼠坐骨神经Beclin1、LC3蛋白表达和Beclin1-mRNA、LC3-mRNA的转录水平均明显降低(P0.01);JMT组大鼠坐骨神经Beclin1、LC3蛋白和Beclin1-mRNA的转录均较DM组升高(P0.05,P0.01)。结论筋脉通可纠正糖尿病大鼠坐骨神经组织的自噬异常。     

痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤过程中自噬与凋亡相关基因调节作用研究

目的:观察痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤(IR)不同阶段自噬与凋亡相关基因的调控作用。方法:将80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、痰瘀同治方组(43 g·kg~(-1)ig)及3-MA干预组(13.5 mg·kg~(-1)iv)。可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min,再灌注2 h复制心肌缺血(MI)及IR模型,利用全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠心肌自噬基因Beclin-1,心肌微管相关蛋白轻链3蛋白(LC3)及抗凋亡蛋白Bcl-2表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠在缺血及再灌注阶段血清CK,LDH含量及心肌Beclin-1,LC3 mRNA表达均显著增强,且Bcl-2 mRNA表达减弱(P0.01);与模型组比较,痰瘀同治组能降低缺血期血清CK及再灌注期CK,LDH含量(P0.05),抑制缺血期Beclin-1 mRNA及再灌注期Beclin-1,LC3 mRNA表达,上调缺血期及再灌注期Bcl-2 mRNA表达(P0.05,P0.01);与假手术组,3-MA组比较,痰瘀同治组在缺血期可上调Beclin-1,LC3 mRNA表达(P0.01)。经相关性检验,缺血期及再灌注期Beclin-1与Bcl-2均呈负相关表达(P0.01)。结论:痰瘀同治方通过促进缺血期自噬发生及抑制再灌注期自噬过表达,同时促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达而发挥其对缺血再灌注损伤心肌的保护作用。     

绞股蓝不同有效成分对ox-LDL诱导内皮细胞自噬效应的影响

目的:探讨绞股蓝不同成分(绞股蓝总皂苷、绞股蓝皂苷XILX、人参皂苷GRb3)对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞自噬效应的影响。方法:采用实时荧光定量PCR法检测自噬相关基因ULK1、Beclin 1的表达;免疫组织化学法分别检测LC3蛋白的表达;Western blotting法检测自噬相关蛋白P-mtor、ULK1、Beclin 1、LC3的表达。结果:与空白对照组相比,模型组ULK1、Beclin 1 mRNA表达减弱;LC3、Beclin 1蛋白表达减弱,P-mtor蛋白表达增多,ULK1蛋白表达减弱,自噬减弱。而Gps、Gp XILX、GRb3处理细胞后,Gps组较模型组ULK1、Beclin 1mRNA表达增强;LC3、Beclin 1蛋白表达增强,P-mtor蛋白表达减少,ULK1蛋白表达增加,自噬增强;GRb3组较模型组Beclin 1 mRNA表达增强;LC3、Beclin 1蛋白表达增强,P-mtor蛋白表达减少,自噬增强;Gp XILX组较模型组,Beclin 1 mRNA表达增加;P-mtor蛋白表达减少,Beclin 1蛋白表达增加。结论:绞股蓝总皂苷、绞股蓝皂苷XILX、人参皂苷GRb3能不同程度的上调ox-LDL诱导内皮细胞的自噬效应,降低内皮细胞损伤。     

新风胶囊对佐剂性关节炎大鼠Beclin1/PI3K-AKT-mTor的影响

目的观察佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜中自噬相关基因5、7、12(Atg5,7,12)mRNA、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬标志物Beclin1、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白(m Tor)及血清细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的表达水平变化及新风胶囊对其的影响。方法将48只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、西药组(来氟米特,5.0 mg/kg)和中药组(新风胶囊,3.0 g/kg),每组12只。干预30天后,观察各组大鼠体质量、足趾肿胀度(E%)、关节炎指数(AI)及踝关节病理及超微结构变化;检测大鼠滑膜中Atg5、7、12 mRNA表达;检测滑膜LC3-Ⅱ、Beclin1、PI3K、AKT、m Tor蛋白表达;检测大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10含量。结果与正常组比较,模型组E%、AI、IL-1β、TNF-α升高,体重、IL-4、IL-10、Atg5 mRNA、Atg12 mRNA、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达降低(P0.01,P0.05),PI3K、AKT、m Tor蛋白表达升高(P0.01)。与模型组比较,两个给药组E%、AI、IL-1β、TNF-α、Atg12 mRNA、PI3K、AKT、m Tor蛋白表达降低(P0.01,P0.05),IL-4、IL-10、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达升高(P0.01,P0.05);西药组Atg5降低(P0.01),Atg7 mRNA升高(P0.05)。与西药组比较,中药组体重、IL-4、Atg5 mRNA、Atg12 mRNA、PI3K、m Tor蛋白表达升高(P0.01,P0.05)。结论AA大鼠滑膜细胞自噬水平下降,导致滑膜细胞的过度增生,引起关节肿胀,致炎因子上升,抑炎因子下降,引起关节的炎症反应。中药新风胶囊可以改善关节炎指数、足趾肿胀度,改善滑膜自噬相关基因及蛋白表达。     

化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后神经细胞自噬途径中Beclin1与LC3蛋白表达的影响

[目的]观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)溶栓后神经细胞自噬途径中自噬相关蛋白(Beclin1)及微管相关蛋白轻链3(LC3)蛋白表达的影响。[方法]选择160只健康SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组(简称中药组),每组采用6 h、1 d、3 d和7 d 4个时相。采用自身栓子法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO),rt-PA组与中药组分别给予尾静脉注入rt-PA(浓度为5.67 mg/kg)及联合化痰通络中药(浓度为7.2 g/kg)干预,每日2次。于相应时间点采用Western blot检测各组大鼠大脑皮质梗死区组织中Beclin1及LC3蛋白的表达。[结果]Western blot结果显示:与假手术组相比,模型组在4个时相中Beclin1和LC3蛋白的相对丰度值均明显增高(P0.05);采用rt-PA和rt-PA联合化痰通络法干预后,4个时相内Beclin1与LC3蛋白的相对丰度值均明显下降(P0.05);且rt-PA联合化痰通络组下降更加显著,与rt-PA组比较差异有统计学意义(P0.05)。[结论]化痰通络方可通过降低神经细胞自噬途径中Beclin1与LC3蛋白的表达,部分抑制神经细胞的过度自噬,进而保护神经细胞损伤,从而更好的防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注的发生与发展。     

电针对CSR大鼠神经细胞自噬相关因子Beclin1 mRNA、LC3 mRNA表达的影响

目的通过观察电针颈夹脊穴对神经根型颈椎病(CSR)大鼠神经细胞自噬相关蛋白Beclin1 mRNA、LC3 mRNA表达的影响,探讨其对CSR大鼠镇痛过程中对自噬调控的作用机制。方法 SPF级SD大鼠按随机数字表分为模型组、针刺组、电针组,每组各10只。采用手术方法将尼龙渔线放至大鼠C6-7、T1神经根腋下复制CSR模型。造模后第3天开始取双侧C2-3、C6-7节段颈夹脊穴进行,电针组进行电针治疗,针刺组进行针刺治疗,每天1次,每次20min;模型组造模后第3天开始每天抓取1次;各组大鼠连续干预7天后处死。治疗后采用YLS-3E型痛分析仪测量机械性痛阈,WB法检测自噬底物P62蛋白的表达,RT-PCR法检测脊髓及神经组织Beclin1 mRNA、LC3 mRNA的表达。结果与模型组比较,电针组及针刺组各大鼠的痛阈值较模型组明显升高(P0.01);电针组与针刺组比较,电针组各大鼠的痛阈值较针刺组明显升高(P0.05);与模型组比较,电针组及针刺组的脊髓及神经组织P62的蛋白含量显著降低(P0.01)。与模型组比较,电针组及针刺组的脊髓及神经组织Beclin1 mRNA、LC3的mRNA含量显著升高(P0.01)。电针组与针刺组相比,脊髓及神经组织Beclin1 mRNA、LC3 mRNA含量显著性升高(P0.05)。结论电针及针刺颈夹脊穴对CSR大鼠均具有显著镇痛作用,可通过调节大鼠脊髓及神经组织神经细胞的自噬保护神经细胞,且电针颈夹脊穴疗效优于针刺颈夹脊穴,其作用机制可能与上调Beclin1 mRNA、LC3 mRNA有关。     

基于自噬基因Atg5和Beclin1探讨益气活血方对大鼠心肌缺血损伤的保护作用

目的探讨益气活血方是否通过调节自噬相关基因Beclin1和Atg5的表达调控发挥对心肌缺血的保护作用。方法将60只健康SD大鼠随机分成空白组、模型组、地奥心血康组、益气活血方高、中、低剂量组,通过腹腔注射异丙肾上腺素制备急性心肌缺血损伤模型。观察心肌梗死面积、心肌细胞超微结构,检测自噬基因Atg5、Beclin1 mRNA和凋亡基因Caspase-3 mRNA的表达。结果益气活血方高、中剂量组各项指标均明显高于模型组,益气活血方各剂量组大鼠心肌组织中Atg5、Beclinl mRNA表达量均升高(P0.01或P0.05),Caspase-3mRNA表达量降低(P0.01或P0.05)。结论益气活血方可以通过上调自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达,增强细胞自噬,下调Caspase-3mRNA表达,从而发挥对心肌缺血的保护作用。     

电针“足三里”对功能性消化不良模型大鼠胃窦Cajal间质细胞自噬的影响

目的探讨电针"足三里"治疗功能性消化不良的可能机制。方法将32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、假电针组,每组8只。除空白组外,其余大鼠均采用多因素应激干预法建立功能性消化不良大鼠模型。电针组采用毫针直刺双侧"足三里"15～20 mm,后接韩式穴位神经刺激仪。假电针组采用安慰针灸针针刺双侧"足三里"后不连接电针仪。以上两组均每次干预20 min,每日1次,连续7天。空白组不施加干预措施,模型组仅抓取固定。干预结束后检测各组大鼠胃内残留率和小肠推进率,检测胃窦组织酪氨酸激酶受体(c-kit)、微管相关蛋白1轻链3 (LC3)及自噬基因Beclin1蛋白及mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠胃内残留率升高,小肠推进率降低,胃窦组织c-kit蛋白及mRNA表达下调,微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)及LC3 mRNA、Beclin1蛋白及mRNA表达增高(P 0. 01);与模型组比较,电针组胃内残留率降低,小肠推进率升高,胃窦组织c-kit蛋白及mRNA表达上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及LC3 mRNA、Beclin1蛋白及mRNA表达下降(P 0. 05或P 0. 01);模型组与假电针组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3 mRNA指标组间比较差异有统计学意义(P 0. 05),其余指标组间比较差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论电针"足三里"能够改善功能性消化不良模型大鼠胃肠动力障碍,其作用机制可能是通过抑制胃窦Cajal间质细胞过度自噬从而恢复细胞数量发挥作用的。     

电针、艾灸预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响

目的:观察针灸预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响,探讨针灸预处理在MIRI过程中对自噬调控的作用机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缺血预适应(IP)组、电针组和艾灸组,每组8只。冠状动脉结扎法建立大鼠MIRI模型。电针组及艾灸组造模前分别电针或艾灸"内关"穴,每次20min,每日1次,连续7d。HE染色法及透射电镜检测左心室心肌病理形态学的变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况及凋亡指数,Western blot法检测LC 3、Beclin 1蛋白在心肌细胞中的表达。结果:模型组心肌损伤较严重,心肌细胞排列紊乱、边界模糊,炎性细胞浸润,部分横纹坏死、溶解,线粒体结构紊乱、模糊,空泡化严重,并出现大量双层膜结构的自噬小体;IP组、电针组及艾灸组心肌损伤较模型组轻微,肌纤维大多正常,肌丝间局灶性水肿,线粒体丰富伴空泡增多,偶见自噬体。与假手术组比较,模型组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显升高(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达显著下降(P0.01);与模型组比较,IP组、电针组及艾灸组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显降低(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01);电针组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ明显低于IP组及艾灸组(P0.05),而LC 3Ⅰ蛋白表达水平则显著高于IP组及艾灸组(P0.01)。结论:IP、电针或艾灸"内关"穴预处理对MIRI大鼠均具有保护作用,可对MIRI大鼠心肌的自噬产生调节作用,尤以电针最佳,而这种适度调节MIRI过程中的自噬水平可能与下调LC 3Ⅱ、Beclin 1蛋白的表达有关。     

银杏内酯B对阿尔茨海默病大鼠海马Synapsin-1、Beclin1和LC3表达的影响

目的:探讨银杏内酯B(ginkgolide B,GB)对阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,AD)大鼠海马Synapsin-1、Beclin1和LC3的影响。方法:将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、银杏内酯B低剂量组、中剂量组和高剂量组,采用Morris水迷宫检测学习记忆,透射电镜观察自噬,免疫组织化学分析海马Synapsin-1、Beclin1和LC3阳性神经元光密度值,荧光定量PCR检测海马Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ的mRNA水平。结果:中、高剂量银杏内酯B可缩短AD大鼠逃避潜伏期,增加穿越平台次数,减少自噬体,提高海马组织Synapsin-1,降低Beclin1 mRNA和蛋白表达,同时下调LC3-ⅡmRNA水平。结论:银杏内酯B可改善AD大鼠学习记忆能力,可能与海马突触相关蛋白Synapsin-1上调、自噬相关基因Beclin1和LC3水平下降有关。     

清热化瘀方通过调控自噬相关基因P62/LC3保护大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:从自噬相关蛋白P62/LC3角度探讨清热化瘀方对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法:160只大鼠随机分为4组:假手术组(SO组)、模型组(I/R组)、清热化瘀颗粒组(QRHY组)和清开灵颗粒对照组(QKL组)。分别于再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d取材(n=10)。线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,分别采用透射电子显微镜观察神经元自噬及凋亡形态结构变化,qRT-PCR和Western blot观察P62及LC3 mRNA及其蛋白表达变化。结果:①大鼠脑缺血再灌注后激活自噬,再灌注后12 h至3 d可见自噬小体出现,之后自噬表达逐渐下降,细胞发生迟发性神经元死亡; QRHY方能减轻上述损害; ②I/R组LC3 mRNA及其蛋白表达均于缺血再灌注后12h开始明显上升,24 h达高峰(P<0.01),随后其表达渐趋下降(P<0.05); 而P62 mRNA及其蛋白表达时相变化则与之相反(P<0.05或P<0.01); QKL组较I/R组P62表达明显升高,LC3表达明显降低(P<0.05); QRHY 组较QKL组进一步升高P62表达,降低LC3的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:清热化瘀方可能通过调节P62/LC3信号通路而减轻自噬的程度,从而达到减轻脑缺血再灌注损伤,保护神经元的作用。     

补阳还五汤对脊髓缺血再灌注损伤后细胞自噬相关蛋白影响的研究

目的:探讨补阳还五汤对脊髓缺血再灌注损伤(SCII)后细胞自噬相关蛋白Beclin 1、微管相关蛋白1轻3 (LC3)、P62影响的机制。方法:48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、观察组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。模型组腹腔内注射生理盐水,观察组在模型制备的前3天灌胃补阳还五汤,3-MA组腹腔注射3-MA注射液,然后夹闭腹主动脉40 min后开放。模型制备后,在缺血3 h、6 h后进行行为学评分、取材,免疫组化检测Beclin 1、LC3、P62的表达。结果:在缺血3 h后、6 h后,与假手术组比较,模型组行为学评分下降(P0.05),Beclin 1、LC3、P62蛋白表达升高(P0.05)。与模型组比较,观察组、3-MA组行为学评分升高,Beclin 1、LC3、P62蛋白表达降低(P0.05)。在缺血3 h后,与3-MA组比较,观察组行为学评分及P62蛋白表达较高(P0.05);在缺血6 h后,与3-MA组比较,观察组行为学评分较高(P0.05),Beclin 1、LC3、P62蛋白表达较低(P0.05)。结论:补阳还五汤通过调节Beclin 1、LC3和P62蛋白的表达,不仅可以促使细胞自噬发生,加快消化、降解受损、衰老、失能的细胞,给细胞的再生、重建提供原料,而且可以抑制细胞自噬过度发生,减少细胞凋亡程序,从而达到双向调节,保护神经细胞的目的。     

健脾益肾化痰方通过VEGF/PI3K/AKT/FOXO1诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞自噬的实验研究北大核心CSCD

目的:观察健脾益肾化痰方含药血清对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡、自噬及SK-MES-1细胞内Beclin1、LC3、VEGFR、PI3K、AKT、FOXO1相关蛋白的影响,探讨健脾益肾化痰方通过上述蛋白诱导肺鳞癌细胞SK-MES-1自噬的可能作用机制。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、32.2 g/kg健脾益肾化痰方组,各组分别灌胃生理盐水或药物,连续7 d后收集血清;采用CCK-8法测定人肺鳞癌细胞株的存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3脂质体转染干预肺鳞癌细胞后自噬发生情况;Western Blot法检测对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1细胞Beclin1蛋白和LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、VEGFR、PI3K、AKT、FOXO1相关蛋白表达的影响。结果:32.2 g/kg健脾益肾化痰方含药血清各浓度组均能够有效抑制肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖,其抑制率与药物浓度呈正相关;与正常对照组相比,32.2 g/kg健脾益肾化痰方16%含药血清组使SK-MES-1细胞凋亡率明显增高(P<0.05);8%、16%含药血清组自噬小体显著增多(P<0.05);16%含药血清组SK-MES-1细胞内自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ表达显著上调(P<0.01);FOXO1蛋白表达显著上调,VEGFR、PI3K、AKT蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:健脾益肾化痰方含药血清能够诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞发生自噬,其作用机制可能是通过调节VEGF/PI3K/AKT/FOXO1信号通路,上调SK-MES-1细胞内Beclin1、LC3蛋白表达,促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ有关。     

电针对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织自噬相关蛋白表达的影响

目的:观察电针"足三里"和"肺俞"对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织自噬相关蛋白及炎性因子表达的影响,探讨电针在COPD发病过程中的作用机制。方法:将雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针组,每组10只。采用香烟烟熏联合脂多糖(LPS)法复制COPD大鼠模型。电针组给予电针双侧"足三里"和"肺俞",隔日治疗1次,每次30 min,持续2周。于治疗结束后检测大鼠肺功能;HE染色法观察大鼠气道及肺组织病理变化;电镜观察大鼠气道及肺组织内自噬小体;实时荧光定量PCR法检测大鼠肺组织内腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)、Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、酵母自噬相关基因6的哺乳动物同源体(Beclin1)mRNA的表达;Western blot法检测大鼠肺组织中AMPK、mTOR、ULK1、Beclin1及微管相关蛋白轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)的表达;ELISA法检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠用力肺活量(FVC)、第0.1秒用力呼气量(FEV0.1)、第0.3秒用力呼气量(FEV0.3)、FEV0.1占FVC比值(FEV0.1/FVC)、FEV0.3占FVC比值(FEV0.3/FVC)均显著降低(P0.01);气道和肺组织内炎性细胞浸润明显,自噬小体明显增加;肺组织内自噬相关蛋白AMPK、ULK1、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平均显著升高(P0.01),mTOR的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.01);BALF内TNF-α、IL-6含量显著升高(P0.01)。与模型组比较,电针组大鼠FVC、FEV0.1、FEV0.3、FEV0.1/FVC、FEV0.3/FVC均显著升高(P0.01,P0.05);气道和肺组织内炎性反应得到明显改善,自噬小体明显减少;肺组织内自噬相关蛋白AMPK、ULK1、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平均显著降低(P0.01),mTOR的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P0.01);BALF内TNF-α、IL-6含量显著降低(P0.01)。结论:电针"足三里""肺俞"可以抑制COPD大鼠肺组织自噬水平,降低肺部炎性反应,改善肺功能。