表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用研究

目的探讨表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因——胞间黏附素A(intercellular adhesion A,ica A)基因、纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen binding protein,fbe)基因、聚集相关蛋白(accumulation-associated protein,aap)基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用。方法实验分为3组,用表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(表葡组)及白假丝酵母菌标准株ATCC10231(白念组)分别培养及混合培养(混合组),建立表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌及二者混合生长的体外生物膜模型。于培养2、4、6、8、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力,二甲氧唑黄[(2,3 bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)5〔(phenylamino)Carbonyl〕2H-tetrazolium hydroxide assay,XTT]比色法评价生物膜体外生长动力学;24、72 h扫描电镜观察生物膜超微结构。荧光定量PCR分析培养72 h表葡组及混合组ica A、fbe、aap基因表达情况。结果结晶紫染色法生物膜半定量检测示,混合组和表葡组均在培养12 h生物膜明显增厚,72 h混合组超过表葡组,组间比较除72 h外,其余各时间点两组比较差异均有统计学意义(P0.05);白念组12 h出现生物膜的生长,在整个培养周期白念组生物膜厚度均低于混合组(P0.05)。XTT比色法生长动力学检测示,混合组整体生长速度快于白念组,且48 h后超过表葡组;混合组与表葡组除12 h差异有统计学意义(P0.05)外,其余各时间点比较差异均无统计学意义(P0.05);混合组培养2、4 h时A值低于白念组,但比较差异无统计学意义(P0.05);6 h后各时间点A值均显著高于白念组(P0.05)。扫描电镜观察示,随培养时间延长各组均形成结构复杂、成熟的生物膜。培养72 h荧光定量PCR检测示,与表葡组相比,混合组fbe、ica A、aap基因表达量分别增高1.93、1.52、1.46倍,差异均有统计学意义(P0.05)。结论表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生长能形成比单一微生物结构更复杂的混合生物膜;混合生物膜较单一微生物生物膜更厚,可能与表皮葡萄球菌ica A、aap、fbe基因表达增加有关。     

雌二醇对乳腺癌假体植入术后表皮葡萄球菌生物膜形成的影响研究

目的探讨雌二醇对乳腺癌术后假体表面表皮葡萄球菌生长以及生物膜形成能力及其结构的影响。方法取表皮葡萄球菌标准株ATCC35984,调整浓度至1×107 CFU/m L或1×108 CFU/m L,与硅胶片和终浓度为125 pmol/L的雌二醇混合培养,制备硅胶材料表面细菌生物膜体外模型。于培养后4、6、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力,XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力;根据以上检测结果,选择细菌悬液实验浓度。取实验浓度表皮葡萄球菌ATCC35984悬液以及终浓度为50、125、250、500 pmol/L的雌二醇悬液,分别与硅胶片混合培养制备生物膜体外模型,以未添加雌二醇悬液(0 pmol/L)作为对照;另取实验浓度表皮葡萄球菌ATCC12228悬液,同法制备模型,作为阴性对照。于培养后4、6、12、24、48、72 h同上法检测硅胶材料表面细菌生长动力及生物膜形成能力,扫描电镜观察硅胶材料表面细菌生物膜超微结构;培养6、12、24 h激光共聚焦显微镜观察硅胶材料表面细菌生物膜厚度。结果根据XTT法及结晶紫染色半定量检测结果,选择浓度为1×107 CFU/m L细菌悬液进行实验。XTT法检测示,ATCC12228和ATCC35984菌株分别在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h时,其125、250、500 pmol/L组细菌生长速度快于0、50 pmol/L组(P0.05),4、6、72 h时500 pmol/L组快于125、250 pmol/L组(P0.05),72 h时250 pmol/L组快于125 pmol/L组(P0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P0.05);同一时间点两种菌株相同雌二醇浓度组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结晶紫染色半定量检测:各时间点ATCC12228菌株各雌二醇浓度组生物膜形成均为阴性。而ATCC35984菌株培养4 h即有生物膜形成,随时间延长逐渐增厚,24 h时达峰值;培养4、6 h,0 pmol/L组生物膜厚度大于125、250、500 pmol/L组(P0.05);12 h开始125 pmol/L组生物膜最厚,与其他组比较差异均有统计学意义(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察示,ATCC35984菌株在培养6 h时125、250、500 pmol/L组的生物膜厚度小于0、50 pmol/L组(P0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P0.05);之后各组生物膜厚度逐渐增加,12、24 h时125 pmol/L组生物膜厚度明显大于其他浓度组(P0.05)。扫描电镜观察示,各时间点与其他浓度组相比,125 pmol/L组形成的生物膜结构范围最广,结构最致密、最丰富、层次最多。结论高浓度雌二醇可促进表皮葡萄球菌生长、生物膜形成和生物膜的成熟。     

表皮葡萄球菌附属基因调节子C特异结合多肽对聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成作用的体外研究

目的探讨表皮葡萄球菌附属基因调节子C(accessory gene regulator C,agr C)特异结合多肽(简称为N1)对聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成作用的体外研究。方法以表皮葡萄球菌ATCC35984(生物膜表型阳性)和ATCC12228(生物膜表型阴性)作为研究对象。首先将两菌株分别加入浓度为100、200、400、800、1 600μg/mL的N1培养,以相同浓度agrC特异结合无关肽(简称为N0)培养作为对照;24 h后测定吸光度(A)值,确定N1最佳抑菌浓度。两菌株与最佳抑菌浓度的N1及N0分别培养,6、12、18、24、30、48 h测定A值,观察N1对表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响;在此基础上与PVC材料片培养6、12、18、24、30 h,扫描电镜观察PVC材料表面生物膜的表面结构;另取与ATCC35984菌株培养6、12、18、24 h的PVC材料片,激光共聚焦显微镜观察生物膜厚度。结果 A值测定显示,N1对ATCC35984菌株最佳抑菌浓度为800μg/mL。ATCC12228菌株与N1及N0培养后均未形成明显生物膜;ATCC35984菌株与N1及N0培养12 h时,生物膜形成能力差异有统计学意义(P0.05),6、18、24、30、48 h时差异无统计学意义(P0.05)。扫描电镜观察,ATCC35984菌株与N1及N0培养后,随时间延长均见成熟生物膜结构;而ATCC12228菌株培养后均未见生物膜形成。激光共聚焦显微镜观察,ATCC35984菌株与N1培养12 h时细菌量明显少于与N0培养,且以死细菌居多;6、18、24 h时两种培养条件下细菌数量未见明显差别,均以活细菌居多;同时,N1培养12、18 h时生物膜厚度明显小于N0培养(P0.05)。结论 N1抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的强度有量效关系;其在聚集期阻碍细菌的增殖和聚集,抑制生物膜形成,对成熟生物膜抑制作用不明显。     

溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探讨溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯(PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,为生物材料表面改性研究及临床生物材料植入感染的防治提供新思路。方法选用化学结构具有代表性的三种溴代呋喃酮分为3组,呋喃酮1组:3,4-二溴基-5-羟基-呋喃酮;呋喃酮2组:4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基)-呋喃酮;呋喃酮3组:3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮;对照组:PVC材料用酒精浸泡5min;分别对4组PVC材料进行表面涂层改性,将改性过的PVC材料与表皮葡萄球菌共同培育;分别于培养6h、12h、18h和24h时用激光共聚焦显微镜动态观察PVC材料表面细菌群落及细菌生物膜厚度的形成,扫描电子显微镜观察PVC材料表面细菌生物膜表面结构。结果激光共聚焦显微镜观测结果显示:呋喃酮2组各时间点PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度明显小于对照组(P0.05),呋喃酮1组、呋喃酮3组表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。扫描电子显微镜观察显示:与对照组比较,呋喃酮2组6h时PVC材料表面细菌群落附着数量较少;18h时对照组PVC材料表面细菌生物膜结构初步形成,而呋喃酮2组无明显细菌生物膜结构形成。结论不同溴代呋喃酮对PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响不同,呋喃酮2可以抑制PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度的形成。     

医用钛板表面涂层2-MPC对细菌生物膜形成的影响

目的探讨医用钛板表面涂层2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine,2-MPC)对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。方法利用化学接枝法制备钛板表面2-MPC涂层并用扫描电镜观察其表面形貌,以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)标准菌株作为实验用菌,将已消毒的2-MPC涂层钛板(实验组)及普通钛板(对照组)置入5 mL细菌浓度为1.5×10~6cfu/mL的菌液中共同培养。分别于体外培养后24 h、48 h行膜内活菌计数和扫描电镜观察。结果扫描电镜观察显示通过化学接枝法制备的2-MPC涂层钛板表面形貌光滑,钛板原先的纹理消失。体外培养24 h、48 h实验组钛板表面活菌计数数量均显著少于对照组(P0.05);扫描电镜观察发现24 h、48 h实验组钛板表面细菌黏附量均明显少于对照组(P0.05),且在48 h时实验组钛板表面菌膜形成量明显少于对照组。结论化学接枝法能有效将2-MPC涂层于钛板表面,且2-MPC涂层可以有效抑制钛板表面细菌黏附,预防钛板表面细菌生物膜的形成。     

医源性表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子在聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成中的作用研究

目的表皮葡萄球菌胞间黏附素基因(intercellar adhesion,ica)是细菌聚集的关键因子,通过分析医源性表皮葡萄球菌生物膜基因型,探讨ica操纵子在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面细菌生物膜形成中的作用。方法取56株医源性表皮葡萄球菌临床分离株,应用PCR法、基因测序技术检测细菌生物膜形成相关基因,包括16S rRNA、自溶素(autolysin,atlE)、纤维蛋白原结合蛋白(fi brinogen binding protein,fbe)以及ica。取医源性表皮葡萄球菌制备浓度为1×105cfu/mL的细菌悬液,并根据目的基因检测结果,分别以icaADB、atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阳性组)以及icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阴性组)与PVC材料培养。于6、12、18、24、30h各取2个PVC材料,进行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察,测量单位视野细菌群落数量及形成的细菌生物膜厚度。结果目的基因检测示,医源性表皮葡萄球菌16S rRNA阳性率为100%(56/56);icaADB、atlE、fbe阳性基因型菌株占57.1%(32/56);icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型菌株占37.5%(21/56)。测序结果示,目的基因16S rRNA、atlE、fbe、icaADB扩增产物序列分别与GenBank中基因序列相符。随时间延长,ica操纵子阴性组的PVC材料表面无明显细菌生物膜形成;ica操纵子阳性组的PVC材料表面细菌群落数量逐渐增多,细菌生物膜体积逐渐增大,24h时可见成熟的细菌生物膜结构,30h时细菌生物膜体积趋于稳定。培养各时间点ica操纵子阳性组PVC材料表面单位视野细菌群落数量(F=435.987,P=0.000)及细菌生物膜厚度(F=6714.395,P=0.000)明显高于ica操纵子阴性组,差异均有统计学意义。结论医源性表皮葡萄球菌可以分为ica操纵子阴性和ica操纵子阳性两类细菌;ica操纵子可以增加PVC材料表面细菌生物膜的形成能力、细菌群落数量及细菌生物膜厚度,在PVC材料表面细菌生物膜形成中具有重要作用。     

利多卡因对细菌培养影响的实验研究

[目的]探讨利多卡因对细菌培养结果的影响,为临床关节假体周围感染(periprosthetic joint infection,PJI)提高细菌培养阳性率提供理论依据。[方法]制备8种标准菌株,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、化脓链球菌和白色念珠菌的菌悬液(3×10~6CFU/ml),模拟临床PJI的关节滑液。各标准菌株的菌悬液分为两组,利多卡因组为2%利多卡因100μl+菌悬液600μl,盐水组为0.45%无菌生理盐水100μl+菌悬液600μl,混匀1 min后,分别接种于5个琼脂平板培养基上进行24 h定量培养,通过菌落计数比较两组培养基上的细菌生长情况。[结果] 24 h定量细菌培养结果表明,利多卡因组金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌菌株的菌落计数显著低于盐水组,差异均有统计学意义(P0.05),而两组间化脓链球菌菌株的菌落计数差异无统计学意义(P0.05)。[结论] 2%利多卡因注射液对临床中常见的PJI病原菌具有很强的抗菌作用。因此,在关节液取样前使用2%利多卡因注射液进行局部浸润麻醉可能影响细菌培养结果。     

烧伤患者深静脉导管细菌生物膜的形成及意义

目的 了解烧伤感染后金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌在深静脉导管中形成生物膜的过程.方法 选择2008年11月-2009年8月在笔者单位住院的20例烧伤患者深静脉导管分离的细菌,分别与各自的标准菌株对照.深静脉导管尖端行扫描电子显微镜(SEM)观察.将菌株体外培养12、24、48、72 h和5 d后,进行细菌生物膜半定量黏附试验测定,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)双荧光染色观察并测定生物膜厚度.对数据进行团体t检验.结果 深静脉导管分离的菌株为金黄色葡萄球菌6株、鲍氏不动杆菌8株、铜绿假单胞菌6株,均为耐药菌株.SEM下可见深静脉导管内层表面形态多样、程度不一的生物膜.细菌被大量胞外多糖复合物包埋、彼此粘连融合成片状,生物膜呈团状聚集,形成立体多样结构,结构内可见少量红细胞,少数细菌被不完全包埋,尚可见黏着的菌体.深静脉导管内分离的金黄色葡萄球菌体外培养24、48及72 h的吸光度值大于界定值;鲍氏不动杆菌培养12、24、48和72 h,吸光度值均大于界定值;铜绿假单胞菌培养48 h后,吸光度值开始大于界定值.CLSM观察可见,培养24 h时,除铜绿假单胞菌标准株外,其余菌株均有散在的绿色荧光,不密集,多数靠近培养皿基底部,红色荧光充满视野.48 h时绿色荧光明显增多,从基底部向上扩延,部分与红色荧光重叠,形成视野中黄色荧光,鲍氏不动杆菌最明显,其次是金黄色葡萄球菌.在绿色荧光的强度和分布上,临床菌株明显多于标准株.培养72 h时铜绿假单胞菌和其标准株的绿色荧光增多,其他菌株图像中黄色荧光布满视野.培养5 d时绿色荧光较分散,以靠近基底部较明显.金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌在培养后48 h形成成熟的生物膜,铜绿假单胞菌则在72h.培养后72 h鲍氏不动杆菌的生物膜厚度为(18.2±3.6)μm,大于标准菌的(9.4±2.6)μm(t=5.42,P<0.05),是3种菌中生物膜最厚者.结论 烧伤临床常见的金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌均能在深静脉导管内形成生物膜,其耐药菌株牛物膜形成能力和程度均大于普通菌株,以鲍氏不动杆菌尤为明显,成为烧伤后导管相关性感染的重要原因.     

溴代呋喃酮对聚氯乙烯材料表面大肠杆菌生物膜形成的影响

目的探讨不同溴代呋喃酮对聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面大肠杆菌生物膜形成的影响,为生物材料表面改性研究及临床生物材料植入感染的防治提供新思路。方法选用具有化学结构代表性的3种溴代呋喃酮,溴代呋喃酮1:3,4-二溴基-5-羟基-呋喃酮,溴代呋喃酮2:4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基)-呋喃酮,溴代呋喃酮3:3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮,分别对PVC材料片(1cm×1cm)进行表面涂层改性,将改性后的PVC材料片与大肠杆菌共同培养;将PVC材料片用75%乙醇浸泡5min后与大肠杆菌共同培养作为对照组。分别于培养6、12、18、24h,采用激光共聚焦显微镜动态观测PVC材料表面单位面积细菌群落数及细菌群落厚度,扫描电镜观察PVC材料表面细菌生物膜表面结构。结果激光共聚焦显微镜观测显示,各时间点溴代呋喃酮3组PVC材料表面单位面积细菌群落数以及细菌群落厚度均小于对照组,差异有统计学意义(P0.05);而溴代呋喃酮1组和溴代呋喃酮2组与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。扫描电镜观察示,与对照组比较,溴代呋喃酮3组培养后6h PVC材料表面细菌群落附着数量较少;18h时对照组及溴代呋喃酮1组和溴代呋喃酮2组PVC材料表面细菌生物膜结构已初步形成,而溴代呋喃酮3组PVC材料表面无明显细菌生物膜结构形成。结论不同溴代呋喃酮对PVC材料表面大肠杆菌生物膜形成的影响不同,3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮可抑制PVC材料表面单位面积大肠杆菌群落数和细菌群落厚度形成。     

假体周围高糖环境对葡萄球菌感染影响的实验研究

目的 探讨假体周围高糖环境对葡萄球菌生长和细菌生物膜形成的影响.方法 利用新西兰大白兔建立假体感染的动物模型,分为金黄色葡萄球菌组(金葡菌组,n=40)和表皮葡萄球菌组(表葡菌组,n=60),每组再随机分为实验组和对照组,实验组注入细菌的同时加入0.1ml质量浓度为1%的葡萄糖溶液,对照组加入0.1 ml生理盐水.金葡菌组分别于第2、4、6和8天观察;表葡菌组分别于2、4、6、8、12和16天观察.对不同时间点的膝关节假体感染动物行细菌计数、扫描电镜和组织学观察.结果 金葡菌组第2天实验组和对照组关节液细菌计数差异无统计学意义(P=0.426),注入细菌后第4、6和8天实验组较对照组细菌生长明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05).扫描电镜观察第2、4、6天实验组较对照组假体表面黏附细菌明显增多(P<0.05),细菌生物膜生成明显.组织学观察第2天实验组假体周围组织发现细菌,而对照组未发现细菌.表葡菌组第2、4、6、8、12和16天实验组与对照组细菌计数差异均无统计学意义(P>0.05),假体表面黏附细菌没有明显区别(P>0.05).组织学观察第2天实验组和对照组假体周围组织均未发现细菌.结论 假体周围高糖环境对金葡菌感染影响明显,而对表葡菌感染影响不明显.     

宁泌泰胶囊对葡萄球菌和大肠杆菌及其生物膜体外形成抑制作用的研究

目的:评估宁泌泰胶囊对葡萄球菌和大肠杆菌增殖以及体外培养生物膜的抑制作用。方法:使用梯度稀释法检测表皮葡萄球菌(1457),金黄色葡萄球菌(NCTC8325-4、Newman、MU50),大肠埃希菌(ATCC25922、CFT073)对宁泌泰的最低抑菌浓度(MIC);使用扫描电镜,观察不同浓度的宁泌泰对表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4,以及大肠埃希菌CFT073和ATCC25922生物膜形成的影响。结果:MIC检测结果显示,宁泌泰对表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4、Newman、MU50以及大肠埃希菌ATCC25922和CFT073均具有抑制效果,MIC为20 mg/ml;扫描电镜结果显示,宁泌泰能够抑制表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4,以及大肠埃希菌CFT073和ATCC25922体外生物膜的形成。结论:宁泌泰胶囊既能够抑制葡萄球菌和大肠杆菌的增殖,也能够抑制其生物膜的形成,具有较为全面的抗细菌效果。     

急性期骨科钛合金板表面金黄色葡萄球菌细菌生物膜的结构演变

目的 采用激光共聚焦显微镜及扫描电子显微镜技术动态观察急性期(4周)内不同时相点钛合金板表面金黄色葡萄球菌的生物膜结构。方法 使用骨科钛合金板培养体外金黄色葡萄球菌形成不同时相点的生物膜，在培养1周、2周、3周、4周后取出钛合金板，用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白和碘化丙啶染料将不同时相点的生物膜染色，染色后使用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察细菌生物膜的形态结构。结果 得到不同时相点的生物膜的激光共聚焦图像及显微电镜图像，1周时细菌胞外少量多糖聚合物形成，内部空间结构杂乱无序，表明形成了早期生物膜。随着培养时间的延长细菌胞外多糖聚合物逐渐增多，内部间隙及孔道相互交通，空间结构逐渐复杂。到4周时大量胞外多糖聚合物形成，膜内结构进一步完善，表明形成成熟的生物膜。各时相点内活菌数目，差异无统计学意义(P>0.05);各时相点间生物膜厚度，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 金黄色葡萄球菌细菌生物膜有早期和晚期区别，从早期生物膜到晚期成熟生物膜是一个动态演变过程，表现为细菌生物膜胞外多糖聚合物及内部空间结构的成熟稳定。     

烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜内菌aba Ⅰ基因表达的变化

目的 了解烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜形成过程中,密度感应基因aba Ⅰ表达变化及其对生物膜ECM和细菌耐药性的影响. 方法 2011年1-10月,收集上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤住院患者创面、血液和静脉导管来源的鲍氏不动杆菌耐药菌6株、敏感菌5株.以鲍氏不动杆菌标准菌株ATCC 19606为参照.(1)临床分离株和标准菌株体外常规培养10、24、48 h后,经碘化丙啶染色,用激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜厚度.(2)采用试管培养法,将临床分离株和标准菌株振摇培养10、24、48 h,培养液内漂浮细菌为游离菌,黏附于试管壁的生物膜内细菌为膜内菌.采用实时荧光定量PCR技术检测各菌株中aba Ⅰ基因及pgaB基因的相对表达量(标准菌株基因表达丰度设为1).对实验数据进行方差分析. 结果 (1)鲍氏不动杆菌临床分离株体外培养10、24、48 h,生物膜厚度均超过标准菌株,其中耐药菌株生物膜厚度分别为(28.8±0.6)、(31.7±1.1)、(38.1±3.1)μm,明显高于敏感菌株[(17.1±0.4)、(20.1±1.6)、(25.8±1.7)μm,F值分别为1274.38、206.60、61.73,P值均小于0.05].(2)膜内菌:体外培养10、24、48 h,耐药菌株aba Ⅰ表达量分别为6.6±1.7、25.7±3.5、9.8±3.6,均高于敏感菌株(2.7±1.0、15.0±3.5、4.7±3.2,F值分别为21.82、25.24、6.22,P值均小于0.05);耐药菌株pgaB的表达量分别为37.4±1.1、44.5±3.6、33.1±11.5,明显高于敏感菌株(14.6±0.8、20.0±6.9、18.7±6.8,F值分别为1488.44、57.26、6.01,P值均小于0.05).(3)游离菌:体外培养10、24、48 h,耐药菌株aba Ⅰ表达量均与敏感菌株接近(F值分别为0.24、2.33、0.11,P值均大于0.05);耐药菌株pgaB表达量分别为13.8±3.8、12.5±2.9、23.7±2.1,明显高于敏感菌株(7.0±5.9、5.0±1.3、15.6±6.7,F值分别为5.44、28.42、7.76,P值均小于0.05).(4)膜内菌与游离菌的耐药菌株比较:膜内菌各时相点aba Ⅰ表达量均多于游离菌(F值分别为43.69、286.61、9.98,P值均小于0.05),膜内菌pgaB表达量在10、24 h多于游离菌(F值分别为214.26、283.20,P值均小于0.05).(5)膜内菌与游离菌的敏感菌株比较:膜内菌abaⅠ表达量在培养24 h多于游离菌(F=70.28,P＜0.05),pgaB表达量在10、24 h多于游离菌(F值分别为8.03、22.62,P值均小于0.05). 结论 烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜形成过程中,耐药菌株的密度感应基因aba Ⅰ表达明显增多,可能引起pgaB基因表达上调,导致细菌ECM及生物膜形成增加、耐药性增强.     

纳米非晶金刚石膜抗口腔白色念珠菌粘附作用的研究

目的:观察比较义齿基托镀用纳米非晶金刚石薄膜前后表面白色念珠菌粘附量变化情况,探索纳米非晶金刚石薄膜的抗菌可能性。方法:采用热凝牙托材料制作30mm×10mm×2mm标准试件10个,逐级抛光至1 200目。试件分成两组,每组5个,一组试件双面镀用纳米非晶金刚石薄膜作为实验组,一组不作处理作为对照组,60Coγ杀菌后试件置于试管中培养,观察其表面48h白色念珠菌粘附量差异,同时用扫描电镜观察细菌粘附情况。结果:实验组及对照组试件表面均存在白色念珠菌黏附,实验组明显少于对照组,两者存在显著性差异(P<0.01)。结论:纳米非晶金刚石薄膜能够显著降低义齿树脂基托表面白色念珠菌的粘附量,为其在口腔修复体上的进一步应用提供了实验依据。     

载银羟基磷灰石抗菌涂层体外抗菌性能及生物相容性研究

目的 制备载银羟基磷灰石(hydroxyapatite/Ag,HA/Ag)复合涂层,并探讨其体外抗菌性能及生物相容性. 方法 采用真空等离子体喷涂技术于钛合金(Ti-6Al-4V)基体表面制备HA/Ag复合涂层(银质量百分比为3%).HA/Ag复合涂层及HA涂层分别于2%TBS金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌液培养2、4、7 d后取出,激光扫描共聚焦显微镜观察两种涂层表面生物被膜形成情况,计算生物被膜细菌密度及活菌百分比;扫描电镜观察涂层生物被膜微观形态:MTT法检测细胞毒性及急性溶血实验评价涂层生物相容性. 结果 培养2 d,HA/Ag复合涂层表面金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌生物被膜厚度与HA涂层比较差异无统计学意义(P>0.05);培养4、7 d,均较HA涂层明显减小(P<0.01).生物被膜细菌密度随时间延长而增多,培养2、4、7 d,两种涂层间比较差异无统计学意义(P>0.05).培养2、4、7 d,HA/Ag复合涂层表面金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌生物被膜活菌百分比均较HA涂层明显减小(P<0.01).MTT法测定示两种涂层材料毒性分级均为0级,急性溶血实验示HA/Ag复合涂层及HA涂层材料溶血率分别为0.19%及0.12%. 结论 HA/Ag复合涂层有良好的生物相容性,对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌有明显抗菌作用,无明显细胞毒性和红细胞破坏性,可用于骨科金属植入材料表面提高其骨整合及抗菌性能.     

大蒜素对表皮葡萄球菌在人工关节材料表面粘附的影响

目的探讨大蒜素对表皮葡萄球菌在人工关节材料超高分子聚乙烯和钛合金表面粘附的影响。方法实验分为4组(其中按大蒜素干预的浓度不同具体细分):生理盐水干预组;1 mg/L大蒜素浓度干预组;2 mg/L大蒜素浓度干预组;4 mg/L大蒜素浓度干预组。利用细菌计数和生物膜定量实验观察不同浓度大蒜素干预后对表皮葡萄球菌在超高分子聚乙烯(UHMWPE)和钛合金表面粘附及生物膜形成的影响。细菌粘附数和生物膜量等计量资料使用单因素方差分析评估,组间两两比较使用LSD法。结果在大蒜素浓度分别为0 mg/L、1mg/L、2 mg/L、4 mg/L干预下,单位面积的超高分子聚乙烯材料表面粘附的细菌数分别为(36 312±6 522)CFU/mm2、(30 624±8 728)CFU/mm2、(13 425±6 026)CFU/mm2、(681±249)CFU/mm2,组间差异有统计学意义(F=61.52,P0.05)。钛合金螺钉表面细菌数分别为(76 113±6 504)CFU、(71 155±7 241)CFU、(18 611±6 549)CFU、(7 066±1 249)CFU,组间差异有统计学意义(F=325.42,P0.05)。超高分子聚乙烯表面生物膜吸光度值分别为(4.38±0.55)、(4.17±0.67)、(2.20±0.69)、(0.62±0.38),组间差异有统计学意义(F=81.84,P0.05)。钛合金螺钉表面的生物膜量分别为(3.43±0.51)、(3.29±0.53)、(2.74±0.58)、(0.59±0.25),组间差异有统计学意义(F=66.31,P0.05)。结论亚抑菌浓度的大蒜素能够抑制表皮葡萄球菌在UHMWPE和钛合金材料表面粘附,抑制生物膜在上述材料的形成。     

预定植减少烧伤后肠腔白色念珠菌移位

目的证实白色念珠菌肠道预定植是否减少烧伤后白色念珠菌移位.方法无特殊病原菌(SPF)小鼠65只,分为预刺激组(33只)及对照组(32只).预刺激组,经口给入1.5×109cfu/ml白色念珠菌(cmcc44104)菌悬液0.5ml,二组动物隔离饲养14d后,致以20%TBSAⅢ度烧伤.伤后1h内,两组动物经口给入0.5ml×1.5×108cfu/ml的白色念珠菌.于伤后1、2、3d分批活杀预刺激组及对照组动物.无菌取肠系膜淋巴结(MLN)、末端回肠、盲肠,观察白色念珠菌移位、白色念珠菌肠粘膜表面粘附计数、白色念珠菌盲肠内总量.结果预刺激组动物在伤后1、2、3d均无MLN白色念珠菌培养阳性,对照组分别在伤后1、2d出现阳性;对照组动物伤后各时相点肠粘膜表面白色念珠菌粘附计数均高于预刺激组对应各时相点(P＜0.05);对照组动物伤后各时相的盲肠白色念珠菌量均高于预刺激组对应各时相点(P＜0.05).结论预刺激能提高肠道局部的屏障功能,减少侵入白色念珠菌的增殖、定植、粘附.     

钛板和死骨表面细菌生物膜模型的建立及观察

[目的]探讨所建立的钛板和死骨表面的细菌生物膜(BBF)模型用于研究同种细菌在不同异物表面的BBF形成能力的可行性,从而指导慢性骨髓炎的治疗.[方法]采用改良的置片培养法建立钛板和死骨表面的BBF模型.用激光共聚焦显微镜采集BBF图像及测量BBF厚度、活菌百分率.[结果]BBF是具有高度组织化的多细胞群体结构.实验组钛板和死骨的BBF厚度分别为(39.20±4.26)μm和(44.70±4.22)μn(P＜0.05).在实验组钛板表面,中层和底层活菌百分率分别为(81.05±10.46)%和(52.20±5.45)%(P＜0.01).在实验组死骨表面,中层和底层活菌百分率分别为(85.50±6.42)%和(57.30±4.92)%(P＜0.01).[结论]此次实验所建立的模型可用于研究同种细菌在不同异物表面的BBF形成能力.金黄色葡萄球菌在死骨表面的BBF形成能力比钛板强.在BBF里,底层活菌的新陈代谢比中层的慢,并且活菌大多被死菌所包裹,这种结构可能是造成慢性骨髓炎难以治愈的原因之一.     

联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜作用的体外研究

目的观察连花清瘟胶囊水溶解物与头孢替唑钠联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜的体外破坏作用。方法药物分为头孢替唑钠组、连花清瘟组、联合用药组和空白对照组;微量肉汤稀释法分别测定连花清瘟胶囊水溶解物和头孢替唑钠对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度;用酶标仪检测金黄色葡萄球菌生物膜内活菌数变化;用扫描电镜观察金黄色葡萄球菌生物膜内细菌受药物作用后的形态和大小。结果连花清瘟组活菌数较空白对照组低(P0.05);头孢替唑钠组与空白对照组相比差异无统计学意义(P0.05);联合用药组活菌数低于单独用药组(P0.05)。扫描电镜显示头孢替唑钠组生物膜中,大量细菌密集在一起,但密度较空白对照组稀疏,细菌形态基本正常,大小基本一致;连花清瘟组生物膜中形态不规则,大小不一致;而联合用药组形态更加不规则,大小更加不一致。结论连花清瘟胶囊水溶解物对金黄色葡萄球菌生物膜具有显著破坏作用,与头孢替唑钠联合应用可起到协同增效的作用。     

宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的:检测宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌体外培养生物膜的抑制作用,探讨其抗菌机制。方法:体外培养表皮葡萄球菌产膜菌株,使用半定量粘附实验结晶紫染色法及刚果红实验检测,评估宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用。宁泌泰胶囊处理后,检测表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受及抗生素敏感性(最小抑菌浓度)的变化,并通过实时荧光定量PCR检测氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2转录水平变化。结果:结晶紫染色法显示,宁泌泰胶囊能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成(P0.001),刚果红实验结果与此一致。在宁泌泰胶囊20 mg/m L浓度条件下,表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受性减弱了8倍,对氯霉素及红霉素敏感性均增强了4倍;实时荧光定量PCR显示,与阴性对照组相比氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2转录水平分别降低至22.9%和24.5%。结论:宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜具有显著抑制作用,减弱细菌对氧化胁迫耐受性,其机制可能通过下调表皮葡萄球菌氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2表达水平实现;同时宁泌泰胶囊可以减弱表皮葡萄球菌对抗生素耐药性。