关节软骨源性微载体生物相容性及异位成软骨特性观察

目的 观察改良后软骨源性微载体的微观结构及主要成分,其对软骨细胞增殖的影响及体内异位成软骨特性.方法 将新鲜猪软骨片粉碎后,梯度筛滤后得到直径大200～400 μm的软骨源性微载体,经1%十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞处理后,Hoechst 33258荧光染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察微载体的主要成分;体外复合软骨细胞后,通过MTT观察软骨源性微载体对软骨细胞增殖的影响;将复合有软骨细胞的软骨源性微载体包埋于裸鼠皮下观察其异位成软骨能力.结果 改良后的微载体形态近似椭圆形,直径200～400 μm,微丝覆盖其表面,微丝长度40～90 nm;脱细胞处理后Hoechst 33258荧光染色阴性;甲苯胺蓝和番红花O组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,第1天以后软骨源性微载体组及条件培养基组的OD值均高于完全培养基组（P〈0.05）;复合有软骨细胞的软骨源性微载体具有异位成软骨能力.结论 本实验成功制备的软骨源性微载体,可作为天然微载体高效扩增软骨细胞,可为组织工程提供优质种子细胞;其具有异位成软骨能力,有望成为软骨组织工程的新型支架.     

关节软骨源性微载体生物相容性及异位成软骨特性观察

目的 观察改良后软骨源性微载体的微观结构及主要成分,其对软骨细胞增殖的影响及体内异位成软骨特性.方法 将新鲜猪软骨片粉碎后,梯度筛滤后得到直径大200～400 μm的软骨源性微载体,经1%十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞处理后,Hoechst 33258荧光染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察微载体的主要成分;体外复合软骨细胞后,通过MTT观察软骨源性微载体对软骨细胞增殖的影响;将复合有软骨细胞的软骨源性微载体包埋于裸鼠皮下观察其异位成软骨能力.结果 改良后的微载体形态近似椭圆形,直径200～400 μm,微丝覆盖其表面,微丝长度40～90 nm;脱细胞处理后Hoechst 33258荧光染色阴性;甲苯胺蓝和番红花O组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,第1天以后软骨源性微载体组及条件培养基组的OD值均高于完全培养基组（P〈0.05）;复合有软骨细胞的软骨源性微载体具有异位成软骨能力.结论 本实验成功制备的软骨源性微载体,可作为天然微载体高效扩增软骨细胞,可为组织工程提供优质种子细胞;其具有异位成软骨能力,有望成为软骨组织工程的新型支架.     

新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

自体富血小板血浆诱导兔脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]体外分离、培养、鉴定兔脂肪干细胞,探讨富血小板血浆体外诱导脂肪干细胞成软骨分化潜能。[方法]取Ⅰ型胶原酶消化兔脂肪后,贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分别予以成脂、成骨诱导,证实其多向分化潜能;同时取第3代细胞予以富血小板血浆诱导,2周后倒置显微镜观察细胞形态,行Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。[结果]可以从兔脂肪中培养出脂肪干细胞,成脂、成骨诱导证实其多向分化潜能。经自体富血小板血浆诱导的脂肪干细胞,其Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。实时荧光定量PCR检测发现经自体富血小板血浆诱导的兔脂肪干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于对照组未经诱导的兔脂肪干细胞(P<0.01)。[结论]自体富血小板血浆可以有效诱导兔脂肪干细胞表达II型胶原和蛋白聚糖,可以诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化。     

来源于长管状骨的组织工程纤维环支架的理化特性及细胞生物学相容性研究

[目的]以来源于长管状骨的骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)为材料制备纤维环支架,并检测其理化特性及细胞生物相容性.[方法]以猪股骨近端松质骨为材料,制备外径为1 cm、内径为0.5 cm的中空环,经脱钙脱细胞处理后制成纤维环支架.支架行Hoechst 33258、HE、Ⅰ型胶原免疫荧光、天狼星红染色,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察并计算孔径,同时进行生物力学测定.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)检测支架不同浓度浸提液的细胞毒性,取P1代山羊纤维环细胞,用注射器将细胞接种至支架上,体外培养48 h,通过活/死细胞染色(LIVE/DEAD cells staining)、扫描电镜(SEM)、HE染色评价支架与细胞的生物相容性.[结果]大体观察支架表面光滑,呈乳白色,扫描电镜支架孔隙分布较均匀且相连通,支架孔径为(401.4±13.1) μm,Hoechst 33258、HE染色均未见细胞残留,Ⅰ型胶原免疫荧光阳性,天狼星红染色支架红染,支架压缩弹性模量为(47.75±6.32) kPa.四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组间细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05),活/死细胞染色示细胞在支架上呈绿色荧光,扫描电镜和HE染色示细胞粘附在支架孔隙表面及周围,有基质分泌.[结论]以来源于长管状骨的骨基质明胶为材料制备的中空环形支架脱细胞彻底,具有合适的孔径结构,在机械性能、组成方面与正常纤维环相接近,具有良好的生物相容性,符合组织工程纤维环支架载体的条件.     

羊颈动脉脱细胞血管基质的制备及其生物相容性评价

目的研究脱细胞血管基质快速高效的制备方法并对其进行生物相容性评价,为组织工程血管的研究寻找合适的支架材料。方法取20根长50mm新鲜山羊颈动脉经-80℃冷冻、37℃水浴复温,反复冻融3次,在506MPa、4℃条件下超高压处理20min,0.125%SDS中37℃振摇(100r/min)12h,彻底去除细胞后,行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察及生物力学测定研究其组织结构的变化;Hoechst33258荧光染色和细胞DNA残留量分析评价脱细胞效果;通过接触细胞毒性实验、MTT活性测试及皮下埋植实验对制备的脱细胞血管基质进行生物相容性分析。皮下埋植实验取清洁级SD大鼠10只,体重200～230g,分为2组(n=5),实验组于大鼠背部皮下埋植结合物理化学方法处理的脱细胞血管基质,对照组埋植单纯物理方法处理的脱细胞血管基质,分别于术后1、2、3、4、8周取出行HE染色观察。结果 HE染色及Masson染色显示脱细胞血管基质无细胞成分残留,保持较完整的胶原成分;扫描电镜观察血管表面以胶原为主,适合细胞黏附;Hoechst33258荧光染色脱细胞血管基质材料未见明显阳性核染色;苯酚-氯仿提取脱细胞血管基质残留DNA含量,电泳检测分析显示其中DNA含量较正常血管显著降低;生物力学检测示脱细胞血管基质最大荷载时的应力及应变与正常血管比较差异无统计学意义,保持了正常血管的力学特征;接触细胞毒性实验与MTT法测定示脱细胞血管基质与细胞有良好的黏附性,细胞毒性为0～1级;实验组皮下埋植术后8周材料周围基本未见炎性细胞,对照组仍有明显淋巴细胞浸润。结论经反复冻融、超高压及小剂量SDS处理的脱细胞血管基质是一种构建组织工程血管的理想支架材料。     

特殊染色技术在骨关节炎关节软骨形态学研究中的比较

[目的]探讨多种特殊染色技术在骨关节炎关节软骨组织形态学研究中的染色规律及应用中的优缺点。[方法]15个月龄健康C57BL/6J小鼠20只,随机分为正常组和骨关节炎模型组各10只,骨关节炎模型组行单侧膝关节前交叉韧带横断加内侧半月板切除术建立骨关节炎模型,正常组仅切开单侧滑膜囊行假手术,3个月后膝关节取材。对标本固定、脱钙后进行石蜡包埋、切片。分别采用HE染色、番红O-固绿双染色、Masson染色、Van Gieson染色、苦味酸天狼星红染色、SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色和II型胶原免疫组化染色,观察骨关节炎关节软骨组织形态学变化,并对几种染色方法进行比较。[结果]HE染色可以显示骨关节炎关节软骨的一般形态结构,可见模型组出现退行性变化;番红O-固绿双染色和Masson染色在显示结构方面的优势优于HE染色,模型组退变更明显;Masson染色、Van Gieson染色、苦味酸天狼星红染色和II型胶原免疫组化染色可定位II型胶原,模型组显示II型胶原含量减少;SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色可见模型组衰老细胞增多。[结论]在骨关节炎关节软骨的形态学研究中,番红O-固绿双染色和Masson染色有利于获得全面的信息,II型胶原免疫组化染色有利于对II型胶原进行定位定量;SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色有利于分析细胞衰老情况。     

人脱细胞半月板的制备

目的：研究人脱细胞半月板的制备及其形态结构和生物力学性能。方法：切取人半月板制备人脱细胞半月板,用HE、甲苯胺蓝、天狼星红、番红花O、AB染色和Hoechst-33258染色等方法进行定性检测,扫描电镜进行形态学观察,用生物力学机测定其在不同压缩比率下的瞬时形变恢复率,最大形变恢复率及最大受压强度。结果：各种染色均显示细胞陷窝内已无细胞结构,Hoechst-33258染色显示无细胞残留,天狼星红染色为阳性,电镜观察示半月板表面及内部不规则存在空虚的陷窝。人脱细胞半月板的孔隙较大,孔隙直径为80～760 μm,孔隙率在67%以上。生物力学测定其压缩30%时,最大瞬时形变恢复率为（89.62±1.04）%,最大形变恢复率为100%,最大强度是（3.04±0.13）N.结论：人半月板经去污剂等处理后,去除了细胞成分,保留了三维立体结构的细胞外基质,具有一定的生物力学性能;成功制备的人脱细胞半月板可作为半月板组织工程的支架载体。     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.     

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价北大核心CSCD

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。