甘氨脱氧胆酸对人肝癌细胞增殖抑制与诱导凋亡的实验研究

目的探讨甘氨脱氧胆酸（GDCA）对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响以及细胞凋亡作用。方法采用96孔细胞培养板体外培养人肝癌细胞株SMMC7721，在24、48、96h后加入GDCA，并进行四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验，计算肝癌细胞的生长抑制率；采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的影响。结果GDCA对肝癌细胞SMMC7721有增殖抑制作用，GDCA作用细胞72h后，200、400、800／μmo／L GDCA抑制率分别为18．18％、29．94％和88．54％；细胞周期分析显示，G1期细胞比例与对照组相比明显升高，GDCA200、400／μmol／L处理组P〈0．05，S期有不同程度的下降，GDCA400／μmol／L处理组P〈0．01。Annexin V-FITC检测结果显示GDCA 200、400μmol／L处理组48和72h后细胞凋亡比例比对照组明显增加，差异具有统计学意义。结论GDCA对人肝癌细胞有增殖抑制作用，并能诱导SMMC7721细胞凋亡。     

阿托伐他汀钙调节人脐静脉内皮细胞E-选择素和细胞间黏附分子1表达的浓度依赖性

目的：观察具有调脂作用的阿托伐他汀钙在不同浓度下对肿瘤坏死因子诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞表达E-选择素和细胞间黏附分子1的影响。 方法：①实验于2002-05／2003-12在大连医科大学附属第二医院实验室完成。将健康婴儿脐带进行无菌处理，用D-Hank’s液冲洗脐静脉，1g/L胶原酶消化、离心，置于37℃、体积分数0．05 CO2培养箱中培养，选择第2,3代细胞作为实验用。②用肿瘤坏死因子40μg／L、不同浓度（0．005～10μmol／L）的阿托伐他汀钙与体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育24h后，提取细胞的总RNA，采用半定量反转录聚合酶链反应在mRNA水平进行分析。③用曲线图表示E-选择素和细胞间黏附分子1表达在不同浓度阿托伐他汀钙影响下的变化趋势。 结果：①在mRNA水平，阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导的人脐静脉内皮细胞所表达的E-选择素与细胞黏附分子1均具有浓度依赖性。②阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞表达E-选择素mRNA呈促进作用，即阿托伐他汀钙在0～10μmol／L的浓度区间内，随着其浓度由0，0．005,0．01μmol／L渐升至10μmol／L，E-选择素mRNA的表达呈逐渐升高的趋势。③阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞间黏附分子1的影响呈双向性，具有浓度差异性。即随着阿托伐他汀钙浓度由0,0．005,0．01μmol／L升至0．05μmol／L，细胞间黏附分子1 mRNA表达呈逐渐下降趋势，而在高浓度（0．05-10μmol／L）区间，随着阿托伐他汀钙浓度0．05，0．1μmol／L渐升至10μmol／L，细胞间黏附分子1 mRNA的量呈逐渐升高的趋势。 结论：在基因水平，阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞黏附分子的表达有着确切的调节作用，且存在着浓度依赖性，并在不同的浓度区间，对不同的黏附分子作用不同。     

盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的干预

目的：观察盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的影响。 方法：实验于2005-02／08在西京医院神经内科实验室完成。人脐静脉内皮株细胞培养，取第4—7代指数生长期细胞，接种到96孔板，24h细胞贴壁后换液，加入药物处理，随机分为正常对照组、同型半胱氨酸组及盐酸氟桂利嗪组3组，正常对照组，仅予空白RPMI-1640培养基培养24h；同型半胱氨酸组，分别加入终浓度为100μmol／L、200μmol／L、500μmol／L．1000μmol/L的同型半胱氨酸培养24h；盐酸氟桂利嗪组：加入终浓度为10μmmol／L盐酸氟桂利嗪及终浓度分别为100μmol／L、200μmol／L、500μmol／L、1000μmol／L的同型半胱氨酸，培养24h。以上每组各种浓度共8孔。用ELISA法检测各组不同培养条件下可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的吸光度值（波长490nm）。 结果：同型半胱氨酸组中随着培养液同型半胱氨酸浓度的增加可溶性细胞间黏附分子1的吸光度值从（0．143&;#177;0.013）增至（0．175&;#177;0．006），与对照组相比差异有显著性意义（P〈0．01）；可溶性血管黏附分子1从（0．112&;#177;0．008）增至（0．147&;#177;0．014）．与对照组相比差异有显著性意义（P〈0．01）；10μmmol／L的盐酸氟桂利嗪＋100μmol／L同型半胱氨酸组与相同浓度的同型半胱氨酸组相比吸光度值也减少．差异无显著性意义（P〉0．05）；10μmmol／L的盐酸氟桂利嗪＋200μmol／L、500μmol／L、1000μmol／L同型半胱氨酸组的吸光度均低于相同浓度的同型半胱氨酸组．差异有显著性意义（P〈0．01）；表明盐酸氟桂利嗪明显抑制同型半胱氨酸所诱导的可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的表达。 结论：盐酸氟桂利嗪能够减少同型半胱氨酸引起的人脐静脉内皮细胞株黏附分子的上调，可能对细胞具有保护作用。     

辛伐他汀对人脐静脉内细胞CD40／CD40L表达的影响

目的：探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响。方法：实验于2004—03／06在中南大学湘雅二医院实验室完成。实验所用脐带于无菌条件下取自本院产房健康新生儿，产妇知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准。辛伐他汀原粉由杭州默沙东制药公司提供。原代培养人脐静脉内皮细胞，实验在第4代有70％细胞汇合的情况下进行。低密度脂蛋白快速分离后加入含10μmol／L硫酸铜的磷酸盐缓冲液氧化修饰24h，在准备后15d内用于实验。采用流式细胞技术检测CD40／CD40L在细胞上的表达，采用逆转录多聚酶链式反应检测NF-κBP65 mRNA，同时行细胞免疫化学染色检测细胞NF-κBP65的表达。观察辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40／CD40L分子和NF-κB P65 mRNA的影响实验中，共分5组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③低浓度辛伐他汀组，先予1μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。④高浓度辛伐他汀组，先予10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。⑤单纯辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预25h。免疫化学检测人脐静脉内皮细胞NF-κBP65分子表达的实验中，共分3组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。结果：①氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞后CD40／CD40L的表达情况：20-80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h后，CD40／CD40L的表达以浓度依赖和时间依赖的方式增加。②辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响：预先给予辛伐他汀（1μmol／L和10μmol／L）干预1h明显降低氧化低密度脂蛋白所致的CD40／CD40L表达，与单纯氧化低密度脂蛋白刺激组比较，差异显著（P均〈0．05）；10μmol／L的高浓度辛伐他汀较1μmol／L的低浓度辛伐他汀作用更明显（P〈0．05）；而单纯给予10μLmol／L的辛伐他汀干预不影响人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L的表达。③辛伐他汀对NF-v：BP65 mRNA在人脐静脉内皮细胞表达的影响：人脐静脉内皮细胞中加入80mg／L氧化低密度脂蛋白培养24h后NF-κB mRNA的表达明显高于空白对照组（0．53&;#177;0．06，0．08&;#177;0．01，P〈0．01）。而预先给予1μmol／L辛伐他汀孵育lh显著降低氧化低密度脂蛋白刺激升高的NF-κB P65 mRNA，明显低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．31&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01）。高浓度组（10μmol／L）作用更显著，显著低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．14&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01），而单纯给予辛伐他汀（10μmol／L）不影响人脐静脉内皮细胞NF-κB P65 mRNA的表达。结论：氧化低密度脂蛋白以浓度和时间依赖的方式刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L，而辛伐他汀以剂量依赖的方式减轻氧化低密度脂蛋白刺激下人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达，可能与其抑制人脐静脉内皮细胞的NF—κBP65的表达有关。提示辛伐他汀可通过抑制高脂血症患者炎症信号通路而到达抗动脉硬化的作用。     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合柔红霉素对HL-60细胞的凋亡作用和Survivin mRNA表达的影响

目的：研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bor）单用或联合柔红霉素（DNR）对HL-60细胞凋亡和Survivin mRNA表达的影响。方法：将不同浓度Bor,DNR及两药联合组和对照组作用于HL-60细胞,采用MTT法测定细胞增殖活性,RT—PCR检测Survivin mRNA表达。结果：5nmol／L Bor作用24h对HL-60细胞有增殖抑制作用,并诱导其凋亡。随着浓度增加及其作用时间的延长可使细胞凋亡率明显增加,10nmol／LBor与1．0μmol／L DNR联合作用72h细胞凋亡率最高,与同剂量两药单独作用相比差异有显著性（P〈0．01）。RT—PCR检测结果表明：随着药物浓度的增加,Survivin mRNA的表达逐渐下降,10mmol／L Bor与1．0μmol／L DNR联合作用72h Survivin mRNA表达最低。结论：Bor能显著抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,Bor联合DNR对HL-60细胞有协同作用,并能显著下调Survivin基因的表达,这可能是促使HL-60细胞凋亡的机制之一。     

细胞周期蛋白依赖激酶对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinase,CDK）对原发性肝癌（肝癌）细胞增殖及凋亡的影响。方法：对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721分别予浓度为0μmol／L、2μmol／L、4μmol／L、8μmol／L、16μmol／L、32μmol／LCDK抑制剂rosco-vitine干预72h,分别通过倒置显微镜、四甲基偶氮唑蓝法、流式细胞仪、逆转录PCR法观察SMMC-7721细胞的生长、增殖,细胞周期时相的分布、凋亡以及CDK2、半胱氨酸蛋白酶-3和BCL-2mRNA的表达。结果：予roscovitine干预72h后,光镜下可见随着roscovitine浓度的增加,部分细胞核固缩、胞体折光性减弱、胞浆内可见有颗粒和核碎片形成,其中以32μmol／L组的改变最为明显。四甲基偶氮唑蓝法结果显示,不同浓度的roscovitine对细胞生长均有一定的抑制作用,roscovitine对细胞的抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞仪检测发现,经roscovitine干预后肝癌细胞G0期、G1期及凋亡细胞的比例增加。逆转录PCR发现,随着roscovitine浓度的增加．CDK2mRNA及凋亡相关基因BCL-2mRNA水平降低,半胱氨酸蛋白酶-3mRNA表达升高。结论：CDK表达降低可抑制增殖期肝癌细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,凋亡机制可能与BCL-2、半胱氨酸蛋白酶．3的表达改变有关。CDK在肝癌细胞增殖及凋亡中起着重要作用。     

钙三醇干预甲状旁腺素诱导的心肌细胞内钙超载和细胞肥大

目的探讨甲状旁腺素（PTH）对鼠心肌细胞内游离钙（[Ca^2＋]i）和心肌肥大的影响及其机制,以及钙三醇的干预作用。方法培养的新生大鼠心肌细胞以Fluo-3／AM负载,通过激光共聚焦显微术（LSCM）测定细胞内[Ca^2＋]i;以细胞面积和细胞蛋白含量作为心肌细胞肥大指标,体外实验观察PTH瞬时和持续刺激对鼠心肌细胞[Ca^2＋]i和肥大的影响,以及钙三醇的干预作用。结果①在细胞外Ca^2＋为2．5mmol／L时,PTH1-34在0．1和1μmol浓度下的刺激可促使心肌细胞静息[Ca^2＋]i荧光强度（FI）快速上升;1μmol浓度PTH1-34刺激,在细胞外液无钙,或应用10μmol硝苯地平预处理时,心肌细胞静息钙则无明显上升。②培养的心肌细胞应用PTH1-34 0．01和0．1μmol刺激7天后,心肌细胞内钙荧光强度、心肌细胞面积和蛋白含量均较对照组显著增加。若以PTH1-34 0．1μmol刺激,并同时加入0．001μmol的钙三醇干预,上述指标明显降低（P〈0．01）;但应用0．1μmol高浓度钙三醇干预,上述指标则未见显著改善。结论PTH1-34刺激可显著增加培养心肌细胞[Ca^2＋]i,诱导细胞肥大;适宜浓度钙三醇具有保护作用,电压依赖型钙通道的开放引起的细胞外钙内流增加是PTH1-34诱导上述变化的重要机制之一。     

共轭亚油酸对胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的 研究共轭亚油酸（CLA）对体外培养人胃癌MGC-803细胞生长的影响。方法 采用体外培养人胃癌MGC-803细胞，用MTT比色、流式细胞光度术以及Cyclin D1蛋白表达检测的方法，观察不同浓度CLA（50．0、100．0、200．0μmol／L）对MGC-803细胞生长的影响。结果 MTT比色结果显示，不同浓度CLA可抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖，72h的抑制率分别为48．61％、62．02％、66．33％，呈现剂量-效应关系（P〈0．05）。流式细胞仪检测表明，不同浓度CLA（50．0、100．0、200．0μmol／L）作用MGC-803细胞48h，C1期细胞从0μmol／L浓度组的32．2％分别上升到43．1％、59．7％、63．9％，出现G1期阻滞。免疫组织化学结果显示，Cyclin D1蛋白表达随着CLA浓度的增加呈现逐渐下降的趋势。结论 CLA对体外培养的人胃癌MGC-803细胞增殖有良好的抑制作用。     

重组人表皮生长因子对体外培养人角质细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度条件下表皮生长因子对角质形成细胞增殖的影响，分析表皮生长因子对角质形成细胞增殖过程中有无异常影响。方法：实验于2003-09／2005-01在新疆维吾尔自治区包虫病研究所细胞室完成。实验所用细胞从手术中切取的皮片（中厚皮片）获得。采取体外角质形成细胞的原代培养技术，用浓度分别为0．001，0．01，0．1，1，10，100，500μg／L浓度的表皮生长因子干预体外培养的细胞。采用噻唑蓝法检测细胞活性。选择最适浓度表皮生长因子干预的角质形成细胞，用流式细胞仪检测细胞的DNA倍体情况。结果：①角质形成细胞生长过程的观察：细胞培养3d可见部分贴壁，内有各层角质形成细胞；细胞培养12d可见明显的贴壁现象，有圆形或椭圆形细胞核，细胞体呈不规则形态；13d后可见细胞膜片的形成。细胞间隙明显，细胞大部分为多角形。细胞核明显；20d左右可见细胞膜片仍然存在，细胞形态正常，折光性好。②角质形成细胞的鉴定：胞核内可见棕黄色着色，多数可见明显的细胞核。③不同浓度表皮生长因子对人角质形成细胞增殖的影响：进人对数生长期的细胞在表皮生长因子浓度为0．01-100μg/L时，其吸光度值为0．330&;#177;0．014～0．400&;#177;0．018，此浓度下对角质形成细胞有增殖作用；浓度为0．1～1μ／L时，其吸光度值为0．386＋0．043～0．428&;#177;0．024，增殖作用最强；浓度为0．001或500g／L时，其吸光度值为0．344&;#177;0．013和0．251&;#177;0．025，无明显增殖作用。④培养12d时流式细胞仪对表皮生长因子最适浓度下细胞倍体含量的测定：合成前期=95．9％，大多数为二倍体；分裂前期=4．1％，为四倍体；未见非整倍体。细胞分化良好，无异常分化表现。结论：表皮生长因子浓度为0．01～100μg／L时，促角质形成细胞增殖作用明显，在促增殖范围内无致细胞染色体异常分化的现象，细胞多数为合成前期，提示此条件下角质形成细胞具有很强的增生能力。表皮生长因子浓度为500μg／L时，对角质形成细胞有明显的抑制作用，0．001μg／L为最低有效浓度。重组表皮生长因子对细胞生周长期无影响．     

三氧化二砷对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对人脐静脉内皮细胞增殖活力的影响,评价As2O3防治经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后再狭窄的作用。方法将人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)分为对照组和0.001、0.01、0.1、1μmol/L As2O3实验组,4个实验组细胞分别加入含0.001、0.01、0.1、1μmol/L As2O3的DMEM培养液,对照组加入等量不含As2O3的DMEM培养液。培养24、48、72、96h后进行活细胞计数,绘制细胞生长曲线,采用MTT试验观察As2O3对内皮细胞增殖活力的影响。结果细胞生长曲线显示As2O31μmol/L组内皮细胞增殖受抑制,0.001、0.01、0.1μmol/L各组无明显影响;1μmol/L组24、48、72、96h时细胞吸光度值(0.589±0.029、0.723±0.027、0.870±0.026、1.021±0.034)均低于对照组(0.628±0.027、0.898±0.045、1.118±0.031、1.118±0.031),差异有统计学意义(P0.05);1μmol/L组96h时吸光度值高于72、48、24h时,72时高于48、24h时,48h时高于24h时(P0.05)。结论 1μmol/L As2O3对内皮细胞增殖有抑制作用。     

洛伐他汀对高糖诱导大鼠近端肾小管上皮细胞钠钾ATP酶活性的影响

目的洛伐他汀对高糖诱导的原代大鼠近端上皮小管上皮细胞（PTEC）钠钾ATP酶（Na＋,K＋-ATPase）活性的影响。方法采用显微微分离法体外培养大鼠PTEC,进行免疫细胞免疫化学方法鉴定细胞类型。将细胞分为正常对照组[达氏改良伊格尔（DMEM）培养液]、高糖组（25mmol／L）、高糖加小剂量洛伐他汀（高糖＋0．1μmol／LLOV）,高糖加中剂量LOV（1．0μmol／L）组,高糖加大剂量LOV（10．0μmol／L）组,检测洛伐他汀对肾小管上皮细胞氧化应激水平,液闪法测定PTEC的Na＋,K＋-ATPase活性。结果高糖组Na＋,K＋-ATPase活性显著高于正常对照组,小剂量组、中剂量组明显减低,大剂量组显著性减低。结论高糖诱导的PTECNa＋,K＋-ATPase活性明显升高,洛伐他汀对高糖诱导的原代PTEC的Na＋,K＋-ATPase活性的升高有明显抑制作用。     

咖啡因对棕榈酸作用下β细胞增殖和凋亡影响

目的观察咖啡因对游离脂肪酸棕榈酸作用下体外培养的β细胞增殖和凋亡的影响。方法根据不同浓度咖啡因(1、10、25μmol/L)和游离脂肪酸棕榈酸(500μmol/L)同时作用于体外培养胰岛β细胞分为5组:空白组(不含游离脂肪酸)、咖啡因1μmol/L组(含咖啡因1μmol/L+500μmol/L棕榈酸)、咖啡因10μmol/L组(咖啡因10μmol/L+500μmol/L棕榈酸)、咖啡因25μmol/L组(咖啡因25μmol/L+棕榈酸500μmol/L)和PA组(500μmol/L棕榈酸的脂性培养基)。以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法反映细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡并计算凋亡率。结果 PA组细胞培养48小时、72小时、96小时于490nm光密度值分别为0.144±0.011、0.184±0.026、0.261±0.033,明显低于空白组(P<0.05)。咖啡因10μmol/L组培养72小时、96小时光密度值分别为0.274±0.031、0.452±0.039;咖啡因25μmol/L组培养72小时、96小时光密度值分别为0.280±0.049、0.463±0.051,显著高于PA组(P<0.05)。培养96小时PA组细胞凋亡率(40.55±20.33)%,较空白组(6.68±1.09)%明显升高(P<0.05)。咖啡因10μmol/L和25μmol/L组细胞凋亡率分别为(19.12±10.56)%和(20.97±9.75)%,较PA组明显下降(P<0.05)。结论游离脂肪酸棕榈酸导致体外培养β细胞增殖活性显著受抑、细胞凋亡增加。在一定浓度范围内,咖啡因可能改善棕榈酸诱导的胰岛β细胞增殖受抑和细胞凋亡。     

apelin-13下调caveolae可促进血管平滑肌细胞增殖

背景：结合课题组以往研究成果,提出caveolae可能参与apelin-13促血管平滑肌细胞增殖的假设。目的：实验观察细胞膜特殊凹陷结构caveolae参与G蛋白偶联受体APJ的内源性配体apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用。方法：采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用MTT方法观察血管平滑肌细胞增殖,Western Blotting方法观察信号蛋白表达,免疫共沉淀技术检测信号分子复合物的形成。结果与结论：①caveolae结构破坏剂β-环糊精（5mmol/L,25h）可明显增强apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖。②apelin-13（0,1,2,4,8μmol/L）刺激血管平滑肌细胞,caveolin-1的表达下调,在1μmol/L时下调明显。③β-环糊精（5mmol/L）破坏caveolae后,可使apelin-13下调caveolin-1表达的作用增强。④对照组（体积分数为0.1%胎牛血清孵育）及处理组（apelin-13刺激）caveolin-1与PI3K及ERK1/2均有复合物形成,在apelin-13刺激的情况caveolin-1-PI3K复合物减少、caveolin-1-ERK1/2复合物减少,即apelin-13可能促进caveolin-1与PI3K及ERK1/2解离。结果提示细胞膜特殊凹陷结构caveolae参与apelin-13促血管平滑肌细胞增殖作用。     

三七总皂甙对凝血酶诱导VSMCs增殖及pp60c-src活性的影响

目的探讨三七总皂甙(total spaonins of panax notoginseng,tPNS)对凝血酶诱导大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖作用及与pp60c-src活性的关系。方法采用4-10代的VSMCs的单细胞悬液用于实验。通过MTS法测定VSMCs细胞增殖率。用免疫沉淀测定pp60c-src     

17-DMAG体外对结肠癌HT-29细胞的影响及细胞内活性氧的研究

目的 观察17-二甲胺乙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-DMAG）对人结肠癌HT-29细胞增殖、细胞凋亡的影响及其细胞内活性氧（ROS）的变化.方法 用CCK-8检测17-DMAG对结肠癌HT-29细胞增殖影响;AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞检测细胞凋亡率;酶标仪检测细胞内ROS的变化.结果 17-DMAG呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖.0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.5μmol/L作用于HT-29细胞24h后,细胞增殖抑制率分别为（22.17±1.15）％、（28.45±1.16）％、（35.04±1.58）％和（46.85±2.44）％,作用48 h后,细胞增殖抑制率分别为（27.55±0.65）％、（33.33±1.23）％、（46.20±4.76）％和（55.45±4.47）％,作用72h,细胞增殖抑制率分别为（39.19±1.74）％、（44.29±2.00）％、（50.66±2.17）％和（58.84±3.18）％.正常对照组HT-29细胞24h的自然总凋亡率（早期＋晚期）为（2.72±0.57）％,0.25 μmol/L、0.5μmol/L、1.0 μmol/L和2.5μmol/L 17-DMAG干预24h后细胞总凋亡率分别为（5.38±0.46）％、（6.88±0.52）％、（10.44±0.32）％与（17.87 ±4.66）％,17-DMAG作用HT-29细胞24h的凋亡率与对照组细胞凋亡率相比差异有统计学意义（P＜0.05）.0.25 μmoL/L、0.5μmol/L、1.0 μmol/L和2.5 μmol/L 17-DMAG作用HT-29细胞12 h与24h,其活性氧水平均较对照组有不同程度的上升,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 17-DMAG体外呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖,诱导其凋亡,可能部分与细胞内的ROS升高有关.     

尿多酸肽联合亚砷酸对K562细胞凋亡及细胞增殖的影响

【目的】观察尿多酸肽（cDA-2）、亚砷酸、CDA_2与亚砷酸联合体外诱导慢性髓细胞白血病细胞（K562）株凋亡、抑制增殖的作用;探讨CDA-2与亚砷酸联合对诱导K562细胞凋亡及抑制增殖的协同作用。【方法】不同浓度的CDA-2、亚砷酸及二者联合处理K562细胞株,通过MTT比色法检测K562细胞细胞生长率,计算IC50值;应用倒置相差显微镜、A0荧光染色观察细胞凋亡及形态学变化;应用流式细胞术检测细胞凋亡。【结果】①MTT结果显示,在一定的范围内,K562细胞的生长率存在剂量及时间依赖性降低,CDA-2作用K562细胞24h、48h、72h的IC50值分别为75mg／L、59mg／L和37mg／L,亚砷酸作用K562细胞24h、48h、72h的IC50值分别为11．55μmol／L、6．14gmol／L及5．18μmol／L;②荧光染色结果显示,与未加药的对照组相比,二者单药均可促进细胞凋亡,二者联合后凋亡作用更加显著;③流式细胞术显示,cDA-262．5mg／L处理K562细胞24h早期凋亡细胞为（1．77±0．49）％,亚砷酸4umol／L处理K562细胞24h早期凋亡细胞为（1．33±0．58）％,而相同浓度的二者联合用药作用于K562细胞24h早期凋亡细胞为（11．03±0．7）％（P〈0．05）,按照预计效应公式得出,两药联合存在协同作用,且协同作用于24h,两药最低浓度联合时已开始,随着两药浓度的增加,协同作用逐渐增大。【结论】CDA-2、亚砷酸单药及二者联合均可抑制K562细胞株增殖并促进凋亡,二者具有协同作用。     

中电导钙激活性钾通道在多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、侵袭和IgE分泌中的作用

本研究旨在探讨中电导钙激活性钾通道（IKCal）在多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、侵袭及单克隆免疫球蛋白分泌中的作用。应用台盼蓝拒染法检测IKCal阻滞剂克霉唑（clotrimazole,CLO）对MM细胞株U266生存能力的影响;应用Transwell迁移及Matrigel侵袭实验检测CLO对U266细胞迁移及侵袭能力影响;应用双抗夹心法（ELISA法）检测CLO对U266细胞单克隆免疫球蛋白IgE分泌的影响。结果表明,小剂量CLO（≤1．0μmol／L）对U266细胞活力无明显影响。Transwell迁移实验及Matrigel侵袭实验显示,小剂量CLO（≤1．0μmol／L）作用后,u266迁移及侵袭能力明显降低（P〈0．05）。1．00μmol／LCLO作用24h与48h后,细胞上清液IgE浓度分别为（4．98±0．39）、（4．38±0．32）ng／ml,24h与48h对照组IgE浓度分别为（15．41±1．88）、（21．73±2．01）ng／ml,提示1．00μmol／L组与对照组比较具有显著差异（P〈0．05）。结论：CLO通过阻滞IKCal而抑制MM细胞迁移和侵袭及M蛋白分泌,这为MM靶向治疗提供新思路。     

HSP抑制剂对食管鳞癌细胞株 TE-凋亡的影响及作用机制研究

目的探讨抑制热休克蛋白90（Hsp90）对食管鳞癌细胞株TE-1凋亡的影响。方法采用不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L）、不同时间（24、48、72 h）HSP90抑制剂17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素(17-AAG)处理食管鳞癌细胞株TE-1,分别采用MTT法、流式细胞仪及western blot检测细胞增殖、细胞凋亡及Hsp90、Hsp70、Akt、Fas蛋白表达。 结果17-AAG对TE-1细胞体外增殖抑制率和细胞凋亡率有明显促进作用,并呈现时间-剂量依赖性。17-AAG 处理后TE-1 细胞Hsp90、Akt 蛋白表达明显降低,Hsp70、Fas蛋白表达明显上调。 结论17-AAG可显著抑制TE-1增殖,促进凋亡,其机制可能是通过抑制Hsp90活性、影响其相关信号通路所致。       

ADMA可以通过自噬引起内皮细胞死亡

目的探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在体外培养的条件下,是否可以通过自噬引起脐静脉内皮细胞死亡。方法首先,将细胞分为阴性对照组,ADMA(25μmol/L),ADMA(50μmol/L),ADMA(100μmol/L)及阳性对照组雷帕霉素(RAPA,自噬的激动剂,20 nmol/L)刺激人脐静脉内皮细胞24 h。然后应用ADMA(100μmol/L)分别刺激人脐静脉内皮细胞0 h,12 h,24 h,36 h,48 h。最后引入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol/L),分为阴性对照组,ADMA(100μmol/L),3-MA(5 mmol/L)和ADMA+3-MA(100μmol/L ADMA+5 mmol/L 3-MA)。免疫印迹方法检测微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)和酵母自噬相关基因Atg6的哺乳动物同源基因beclin-1的表达水平;实时荧光定量方法检测beclin-1的mRNA表达水平;应用流式细胞仪检测细胞死亡。结果随着ADMA浓度的增加,脐静脉内皮细胞内的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1的表达增加(P0.05),细胞死亡的百分比也逐渐增加(P0.05)。在ADMA浓度为100μmol/L时,随着时间的延长,脐静脉内皮细胞内的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1的表达增加(P0.05),细胞死亡的百分比也逐渐增加(P0.05)。在ADMA(100μmol/L)的基础上应用自噬抑制剂3-MA后,脐静脉内皮细胞内的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1的表达较ADMA组减低(P0.05),同时加入3-MA后细胞死亡的百分比较ADMA组减低(P0.05)。结论 ADMA可以引起人脐静脉内皮细胞发生自噬,自噬的强度具有浓度及时间的依赖性,并可以通过自噬引起人脐静脉内皮细胞的死亡,当应用自噬抑制剂后可以减少这种由于ADMA所致细胞自噬引起的细胞死亡,这说明ADMA可以通过自噬引起内皮细胞死亡,从而引起内皮损伤,这可能是引起内皮功能不全的机制之一。