骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化***★

背景：传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱，并进行支架材料的双面种植，但由于平滑肌细胞取材培养困难，且体外传代有限，双面种植较为困难。 目的：实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性。 设计：基础实验研究。 单位：中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心。 材料：实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。实验室级别为卫生部部属医院开放实验室。1月龄SD大鼠，雌雄不限，体质量80~ 100g，由中山大学实验动物中心提供。新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心。 方法：采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，并应用流式细胞仪检测其表面抗原。采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质，并测定其纯度及特性。将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上，以添加25 ng/L血管内皮生长因子（VEGF165）的培养液进行体外、体内复合培养，检测其相容性。体内实验以细胞单独培养为对照，体外实验以未植入细胞的材料为对照，并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化，分别在4，8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查，并进行免疫组织化学角蛋白染色，检测上皮细胞再生情况。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性。 结果：①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞，行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示，传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%。②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性，镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维。体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性，细胞生长状态良好。③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润，胶原及弹性纤维排列紧密，免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长，8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应，胶原及弹性纤维排列紧密，免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长。 结论：骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性，并且在体内与周围组织有良好的生物相容性，可以作为构建组织工程膀胱的材料。     

膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞中的作用☆

目的：环境因素对干细胞的分化起到重要的作用。实验拟观察经低浓度二甲亚枫进行预诱导后，大鼠骨髓间充质干细胞在体外经膀胱组织匀浆上清液诱导定向分化为平滑肌样细胞的可行性。 方法：实验于2007-04/2007-09在河北医科大学解剖教研室下属细胞培养室完成。①实验材料：4～6周龄100～150 g健康清洁级SD大鼠1只，雌雄不限，8周龄220~250 gSD大鼠4只，由河北医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞，并在体外扩增、传代。选择8周龄SD大鼠进行膀胱组织上清液的制备。取第4代骨髓间充质干细胞用1%二甲亚砜预诱导8 h后，应用膀胱匀浆上清液诱导7 d。以未进行诱导的骨髓间充质干细胞为阴性对照组。③实验评估：观察细胞形态学的变化，并运用免疫细胞化学检测特异性α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。 结果：骨髓间充质干细胞经诱导分化后，细胞呈梭形平滑肌样，融合后形成峰谷状排列，并表达平滑肌特异性蛋白标志物α－平滑肌肌动蛋白，诱导分化率为（45.6±3.5）%，与阴性对照组相比差异具有显著性意义（P < 0.05）。 结论：采用此方法成功诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞免疫学特性研究及在急性肾小管坏死中的应用

骨髓间充质干细胞因其具有强大的增殖能力、多向分化潜能及向损伤组织器官归巢的特点,使得各国学者都试着将其作为“种子细胞”,用于修复损伤的器官组织。在这些“种子细胞”的同种异体甚至异种移植过程中,人们不可避免地考虑到移植排斥问题。但大量资料显示,骨髓间充质干细胞具有独特的免疫学特性,其不表达组织相容性复合物Ⅱ类分子,可阻断树突状细胞的成熟,降低T细胞的免疫应答,并可通过分泌一些可溶性因子来介导免疫抑制。骨髓间充质干细胞这种独特的低免疫原特性使其在人和动物体内可以避免异种移植排斥反应的发生,更加显示出在移植治疗中的优势,也期待成为构建肾脏修复的种子细胞。     

成体干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究现状

成体干细胞存在于已分化的组织器官中，具有明显的可塑性，能跨系统、跨胚层分化，在组织工程和损伤修复领域具有重要的应用价值。在血管组织工程研究领域中，成体干细胞作为种子细胞得到越来越广泛而深入的研究。目前研究表明，具有向血管内皮细胞分化的成体干细胞主要有骨髓间充质干细胞、造血干细胞、脂肪来源的干细胞以及羊膜来源的干细胞等。基于此，就成体干细胞作为种子细胞在血管组织工程领域研究现状进行综述。     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景：半月板损伤后自行修复能力有限，组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞。取第3代的骨髓间充质干细胞，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化，对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液。在诱导第7，14，21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果。 结果与结论：①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d，第4代以后相对延长，为5~9 d。②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变。③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色强度随诱导时间延长而增强。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性，各期染色无明显差异。对照组未见Ⅱ型胶原表达，实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达。提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质，作为半月板组织工程种子细胞来源可行。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较*☆

背景：目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法：密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。 目的：在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。 方法：全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。 结果与结论：全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。 目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。 方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。 结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。 目的：比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异。 方法：采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代。分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d。 结果与结论：胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小。两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106。二者均可分化为脂肪细胞。可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景。     

贴壁和缩短胰酶消化时间培养大鼠骨髓间充质干细胞☆

背景：对于骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增目前已有几种方法，各自均有不同的优劣性。 目的：观察贴壁法和缩短胰酶消化时间的方法体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的特点。 方法：培养初期频繁换液，去除混杂细胞；传代后加入不同诱导剂定向诱导分化，使之分别向脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞方向分化。 结果与结论：该分离培养方法在第3代可以得到纯化的骨髓间充质干细胞。分离培养的细胞纯度高，有良好的增殖和分化潜能。定向诱导培养的细胞能向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞方向分化。