hBDNF基因修饰骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 探讨人脑源性神经营养因子(humar brain- derived neurotrophic factor,hBDNF)基因修饰骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植入大鼠体内后在脊髓损伤区的存活情况、hBDNF蛋白的表达情况及其对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响. 方法 240只成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、损伤组、hBDNF-大鼠MSCs (rMSCs)组和空载体- rMSCs组,每组60只.用Mlen法建立大鼠脊髓损伤模型.造模后7d,于L4～5间隙蛛网膜下腔向hBDNF -rMSCs组、空载体- rMSCs组和损伤组分别注射等体积的hBDNF基因修饰rMSCs悬液、空载体基因修饰rMSCs悬液和PBS.移植后1,2,3,7和14 d分别取损伤脊髓组织,用荧光显微镜观察带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的rMSCs在体内的存活分布情况,用Western blot法检测hBDNF蛋白的表达水平,以原位末端标记法(TUNEL)检测神经细胞的凋亡情况.结果 hBDNF - rMSCs组和空载体- rMSCs组均检测到EGFP基因表达的绿色荧光信号;hBDNF-rMSCs组表达hBDNF蛋白,其表达水平随时间而变化,移植后2d即可检测到hBDNF蛋白表达,移植后7 d hBDNF表达量最高,此后逐渐下降;移植后2,3,7和14 d,hBDNF - rMSC组TUNEL阳性细胞数量最少,空载体- rMSCs组次之,损伤组相对较多,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 脊髓损伤后hBDNF基因修饰rMSCs经蛛网膜下腔移植能聚集生长在脊髓损伤区域,并表达hBDNF蛋白;hBDNF基因修饰rMSCs能够抑制神经细胞的凋亡.     

老年大鼠骨缺损的骨形态发生蛋白-2的基因治疗

目的 通过组织工程和基因工程结合的方法从种子细胞、生长因子、细胞支架三方面满足老年机体骨修复的需要，为这些方法在老年机体的应用提供参考。方法 体外分离、扩增、骨形态发生蛋白-2（BMP2）基因修饰MSCs，检测细胞上清液中BMP2的表达；通过检测成骨细胞标志性蛋白如碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COL Ⅰ-α1）、骨涎蛋白（BSP）、骨桥素（OPN）的表达观察老年大鼠MSCs的成骨分化能力；检测BMP2基因修饰的MSCs与磷酸三钙（TCP）复合物在裸鼠体内的异位成骨能力；将BMP2基因修饰的MSCs／TCP植入老年大鼠骨缺损部位，修复自体股骨6mm节段性骨缺损。结果 BMP2基因修饰的MSCs可以有效分泌BMP2，诱导后第7天有ALP、COLⅠ-α1、OPN、BSP的明显表达，并可诱导裸鼠体内异位成骨。放射学及组织学检测证明BMP2转染的MSCs与TCP载体复合后可成功修复老年大鼠股骨节段性缺损。结论 BMP2基因修饰的老年MSCs可以恢复成骨分化能力，在体内可以成功修复老年大鼠股骨节段性骨缺损，组织工程和基因工程方法可能成为治疗老年性骨骼疾病的新途径。     

种植密度、换液时间对人间充质干细胞原代培养时间的影响

目的 :探讨不同种植密度、换液时间对人间充质干细胞 (hMSCs)原代培养时间的影响 ,从而确定原代培养hMSCs的适宜条件。方法 :分离人骨髓细胞 ,按不同种植密度、首次换液时间分组进行原代培养 ,记录原代培养时间 ,然后进行传代培养和成骨诱导培养 ,并检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素、钙结节表达情况。结果 :hMSCs原代培养种植细胞密度为 1× 10 5～ 3× 10 5/cm2 ,4 8h后换液的方法较合理。经化学药物 (如地塞米松、β -甘油磷酸、维生素C)成骨诱导后 ,hMSCs表达碱性磷酸酶、骨钙素明显增加 ,并可形成钙结节。结论 :合理hMSCs原代培养方法 ,可以快速获得大量的自体种子细胞 ,从而为组织工程化骨的体外构建创造条件。     

骨组织工程学间充质干细胞研究进展

随着骨组织工程的研究进展 ,对种子细胞的来源、增殖、分化等性质的研究成为近年来骨组织工程研究的热点。间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)具有能大量增殖、分化为多种组织细胞和表达外源目的基因等优点 ,因可能成为用于临床的组织工程化骨种子细胞而受到关注。一、骨组织工程种子细胞的来源Friedenstein[1] 于 1976年发现骨髓中的成纤维细胞集落形成单位 (colony -formingunits -fibroblastic ,CFU -F)能形成类似骨或软骨碎片的细胞集落 ,后来证实CFU -F中至少有一部分细胞是MSCs,能分化为骨、软骨、纤维组织、脂肪或肌肉…     

静脉移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤

目的 研究静脉移植骨髓间充质干细胞(bone martow stromal cells,BMSCs)对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响.方法 对10只同种异体SD大鼠的BMSCs进行体外分离、培养、扩增、纯化后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)进行标记;重物打击致瘫痪造模法制成完全性截瘫的同种大鼠脊髓损伤动物模型,制模后7 d完全随机分为A、B、C三组:A组22只,作为BMSCs移植组,经鼠尾静脉注射2×106/ml的BMSCs细胞悬液1 ml;B组22只,作为对照组,注射1 ml培养液;C组22只,作为空白手术对照组.注射后2,3,6周,免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化并计数,观察损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)和巢蛋白的表达,注射后1,2,3,4,5,6周Basso-Beattie-Bresnaban(BBB)评分评估各组后肢运动功能.结果 移植后2,3,6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内.计数发现,移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,3周占4.4%,6周占2.9%;移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达胶质纤维酸性蛋白(glial fribrillary acidic protein,GAFP),约5.4%表达神经元特异性核蛋白(neuronal nuclear antigen,NeuN);移植后2,3,6周,A组GAP-43、NF200、巢蛋白的表达明显高于B、C组(P<0.05);移植后3周开始,A组的BBB评分在各观察时相点明显高于B、C组(P<0.05).结论 通过静脉注射的BMSCs能向脊髓损伤灶内迁徙、存活,表现出对损伤灶的趋化性,并向神经元和星形胶质细胞分化,上调GAP-43、NF200和巢蛋白的表达,改善神经功能,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗.     

携带胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞移植对兔坐骨神经缺损的治疗作用

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)局部长期高表达对坐骨神经缺损的治疗作用.方法 实验组以骨髓间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞,以慢病毒介导的GDNF转染骨髓间充质干细胞后,结合细胞外基质凝胶构建神经移植复合体共同移植入兔20 mm坐骨神经缺损处.以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因.同时设基质凝胶对照组和基质凝胶+MSCs对照组,每组10只.结果 实验组部分兔坐骨神经连续性完全恢复,而两对照组坐骨神经连续性均未完全恢复.转染GDNF基因的MSC迁移距离可达20 mm,提示该移植细胞与宿主细胞具有较好的整合作用,且实验组绿色荧光蛋白(GFP)+胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)、GFP+S100双标细胞占GFP阳性细胞的百分比分别高达70%和60%,而基质凝胶+MSCs对照组以上两种阳性细胞的百分比为40%和30%.结论 移植的基因工程MSCs能够明显促进损伤坐骨神经的再生,GDNF可能促进了MSCs向雪旺细胞样细胞分化.     

携带胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞移植对兔坐骨神经缺损的治疗作用

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)局部长期高表达对坐骨神经缺损的治疗作用.方法 实验组以骨髓间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞,以慢病毒介导的GDNF转染骨髓间充质干细胞后,结合细胞外基质凝胶构建神经移植复合体共同移植入兔20 mm坐骨神经缺损处.以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因.同时设基质凝胶对照组和基质凝胶+MSCs对照组,每组10只.结果 实验组部分兔坐骨神经连续性完全恢复,而两对照组坐骨神经连续性均未完全恢复.转染GDNF基因的MSC迁移距离可达20 mm,提示该移植细胞与宿主细胞具有较好的整合作用,且实验组绿色荧光蛋白(GFP)+胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)、GFP+S100双标细胞占GFP阳性细胞的百分比分别高达70%和60%,而基质凝胶+MSCs对照组以上两种阳性细胞的百分比为40%和30%.结论 移植的基因工程MSCs能够明显促进损伤坐骨神经的再生,GDNF可能促进了MSCs向雪旺细胞样细胞分化.     

骨髓间充质干细胞的成骨研究进展

骨组织工程学研究内容主要包括3方面：①种子细胞的研究；②支架材料的研究；③组织工程化骨的临床应用，其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最基本的环节。作为骨组织工程的理想种子细胞。应具有以下特点：结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；取材容易，对机体损伤小；体外培养增殖能力强；自我更新，一定条件下向特定方向转化；稳定表达成骨细胞表型：植入人体后能继续产生成骨活性；无致瘤性。20世纪70年代中期已证实BMSCs具有自我增殖能力和分化潜能．而且BMSCs具有来源广泛、取材简单、分化成骨潜能强等特点。成为目前骨组织工程种子细胞研究的重点。     

聚乳酸-羟基乙酸／磷酸三钙人工骨的体外构建

目的体外构建兔骨髓间充质干细胞与聚乳酸一羟基乙酸（PLGA）／磷酸三钙（TCP）及PLGA支架材料的复合体,初步评价人工骨构建效果。方法股骨骨穿获得兔骨髓,传代至3～4代,成骨诱导后进行成骨性能检测。同时转染腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）后分别与PLGA及PLGA／TCP支架材料复合,采用激光扫描共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对细肜支架复合物进行形态学观察。结果与结论种子细胞在两种支架上均可黏附、生长：PLGA／TCP复合支架材料较PLGA更有利于细胞生长,为下一步兔自体骨缺损修复提供了良好的实验基础。     

培养人骨髓基质细胞接种多孔陶瓷再造骨组织

为探讨人骨髓基质细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性，作者观察了体外培养的人骨髓基质细胞复合多孔珊瑚羟基磷灰石在体内的成骨能力。穿刺抽吸入髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导后，与多孔珊瑚羟基磷灰石复合，植入裸鼠皮下。术后4、8周取材，通过组织学检查了解植入物体内成骨情况。结果显示，复合物在体内成骨活跃，说明人骨髓基质细胞可以作为骨组织工程的种子细胞，珊瑚羟基磷灰石可作为一种细胞种植基质材料。     

术中富集骨髓细胞构建组织工程骨成骨能力的研究

目的 观察术中富集骨髓干细胞构建的组织工程骨在山羊脊柱横突间融合的成骨效果,为组织工程骨探索一种新型的构建方法.方法 将多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)修饰于山羊脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)制备成基质材料(PLL-DBM);以山羊横突间隙为植骨模型,观察PIL-DBM富集骨髓细胞构建的组织工程骨(Ⅰ A组)的成骨能力;对照组为自体髂骨组(Ⅰ B组)、DBM富集骨髓组(Ⅱ C组)、空白DBM组(Ⅱ D组).于术后第16周取融合段标本行X线片、三维CT及CT值检测和生物力学检测,对比分析、评价其成骨能力.结果 X线表现:ⅠA组、Ⅰ B组融合范围基本相同,明显较ⅡC组宽,Ⅱ D组基本无融合.三维CT:Ⅰ A组的CT值为(696.76±102.75)HU,ⅠB组的CT值为(766.03±69.24)HU,二者差异无统计学意义(P>0.05),均明显较ⅡC组高(P<0.05),Ⅱ C组CT值较ⅡD组高(P<0.01).生物力学性能:Ⅱ A、Ⅰ B两组最大载荷、抗弯强度比较差异均无统计学意义(P>0.05),ⅠA组较Ⅱ C组高(P<0.01,0.05),Ⅰ B组较ⅡC组高(P<0.01),ⅡC组较ⅡD组高(P<0.01). 结论 PLL-DBM术中富集骨髓干细胞快速构建的组织工程骨是一种理想的组织工程骨,其成骨能力与自体髂骨相当.     

Radionuclide bone image in growing and stable bone island

A normal radionuclide bone image can facilitate distinction between a bone island and significant pathologic processes, especially an osteoblastic metastasis. This distinction becomes more crucial when growth is detected in an isolated sclerotic bone lesion or if a relatively large sclerotic lesion is detected de novo in patients with a known neoplasm. This report presents three patients with isolated bone islands: two with interval growth, the other with a relatively large stable lesion; all showing a normal radionuclide bone image.     

Recognition of cortical bone resorption in metabolic bone disease in vivo

This is an outline of radiologic assessment of cortical bone resorption for improved diagnosis of metabolic bone diseases by simple radiographic means: microradioscopy and morphometry. The methodology permits separate assessment of endosteal, intracortical, and periosteal resorption and an evaluation of both the quantity and the quality of cortical bone.     

骨向分化骨髓间充质干细胞的免疫学特性研究

目的 探讨骨向分化骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的免疫学特性. 方法 正常成人骨髓分离的BMSCs在骨向诱导培养基中培养2周后,将未分化的BMSCs和骨向分化的BMSCs与同种异体T淋巴细胞、植物血凝素(PHA)共培养,MTT法检测T淋巴细胞的增殖情况;ELISA法测定骨向分化2周的BMSCs上清以及共同反应5d的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytes reaction,MLR)上清转化生长因子(transforming growth factor -β1,TGF -β1)的浓度,并通过加入抗TGF-β抗体检测MLR情况. 结果 无论是未分化的BMSCs还是骨向分化的BMSCs都不会引起同种异体T淋巴细胞的增殖,并且都能抑制PHA诱导的T淋巴细胞增殖.MLR中的TGF -β1浓度显著升高.抗TGF-β抗体能够抵消骨向分化的BMSCs免疫抑制作用. 结论 骨向分化的BMSCs具有低免疫原性和免疫抑制特性.     

Application of stem cells in bone repair

Bone has the ability to repair minor injuries through remodeling. However, when the host source of osteoprogenitors is compromised at the defect site, one effective treatment may be cell-based therapy, as it replenishes the area of bone loss with cells possessing osteogenic potential. This review is a concise comparison of different types of stem cells that have the potential to be used in tissue-engineered scaffolds for bone repair. The clinical use of mesenchymal stem or stromal cells isolated from the bone marrow for treating various diseases has been well documented. However, the scarcity of these cells prompts the search for alternative sources of multipotential cells such as amniotic fluid stem cells and umbilical cord perivascular cells. Embryonic stem cells are another controversial source of cells with osteogenic potential. These cells have the ability to differentiate into all cell types of the adult body. Issues such as the use of human embryos and the risk of contamination from animal-derived culture components continue to prevent the therapeutic use of ESCs. As a result, abundant research has been carried out to design defined culture conditions for culturing ESCs, and alternative strategies such as the generation of induced pluripotent stem cells are being developed to eliminate the need for using embryos for cell derivation. In addition to the cell source, the ability to control stem cell differentiation into functional bone and the choice of biomaterial are also paramount objectives that are being examined in research and clinical trials.     

人骨髓基质细胞体外扩增方法的研究

 目的 为提高人骨髓成纤维细胞集落(CFU-F)的产率,缩短培养时间.方法 在以往的人骨髓基质细胞体外扩增方法基础上进行了改进,每10ml培养体系中,含1×10<'7>个单个核细胞,以30%人AB血清代替小牛血清,增加了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),再加入氢化可的松和适量的IMDM培养液,培养第9d观察结果.结果 在一定范围内人AB血清、bFGF均能促进CFU-F增殖,提高其产率,并缩短培养时间3～5 d.结论 可应用到人骨髓基质细胞体外扩增及传代中,对于研究CFU-F的性质及在造血疾病中的应用具有重要意义.     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

N-MID、β-CTx与肿瘤骨转移骨显像对比分析

目的:对比分析肿瘤骨转移核素骨显像与骨代谢标志物N-MID、β-CTx的临床应用价值。方法:依据骨显像将恶性肿瘤患者分为无骨转移组和骨转移组,采用Soloway分级将骨转移组病例分为4级,分析N-MID、β-CTx的变化情况。结果:骨转移组β-CTx约为0.42 ng/ml,明显高于对照组0.27 ng/ml(P<0.01);各级骨转移组β-CTx水平分别为:对照组0.24±0.17 ng/ml,1级骨转移组0.31±0.11 ng/ml,2级骨转移组0.56±0.19 ng/ml,3级骨转移组0.81±0.13 ng/ml,4级骨转移组1.10±0.22 ng/ml,β-CTx随骨转移级别增加逐渐升高,仅对照组和1级骨转移组、1级和2级骨转移组间无明显差异(P>0.05),其余各组两两比较均有显著性差异(P<0.01)。骨转移组N-MID水平约18.70 ng/ml,高于对照组14.31ng/ml,但无统计学差异(P>0.05),随骨转移级别增加,N-MID水平有逐渐上升的趋势,但各组间比较无明显差异(P均>0.05)。结论:β-CTx可以应用于骨转移的辅助诊断和2级以上骨转移程度监测,N-MID对肿瘤骨转移的诊断价值和骨转移程度的监测价值不明显。     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

氡暴露致小鼠骨髓细胞的DNA损伤

目的 研究氡暴露致小鼠骨髓细胞的DNA损伤。方法 采用雄性BALB/C小鼠24只,随机分为4组,每组6只,除对照组外,处理组小鼠整体暴露于多功能生态氡室,吸入氡及其子体的累积剂量分别为27(低剂量组)、52(中剂量组)和105(高剂量组)工作水平月(WLM)。采用单细胞凝胶电泳(SCGE)、微核(MN)实验、激光共聚焦显微镜(LSCM)检测小鼠骨髓细胞的DNA链断裂、微核细胞率及凋亡率,观察氡暴露致小鼠骨髓细胞的DNA损伤。结果 高剂量氡暴露可造成小鼠骨髓细胞DNA断裂,尾长和尾DNA百分含量与对照组相比,差异有统计学意义(F=201.9,40.78,P<0.05);微核率和凋亡率增加差异有统计学意义(F=16.28,41.62,P<0.05)。而中、低剂量组则无明显改变。结论 高剂量氡暴露引起DNA损伤,从而对小鼠骨髓细胞产生毒效应。