副溶血弧菌TaqMan双重实时-聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立副溶血弧菌TaqMan实时-PCR和毒力基因TaqMan双重实时-PCR筛检的实验室检测方法。方法根据副溶血弧菌ItoxR/I基因的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测副溶血弧菌的实时-PCR方法;根据副溶血弧菌耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin, Itdh/I）和耐热相关溶血素（thermostable related hemolysin, Itrh/I）基因的保守序列设计引物和探针,建立检测致病性副溶血弧菌毒力基因的双重TaqMan实时-PCR方法。对所建立的副溶血弧菌实时-PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。结果副溶血弧菌的检测下限为10sup2/sup拷贝/l,Itdh/I和Itrh/I双重实时PCR的检测下限为10sup2/sup拷贝/l。针对ItoxR/I基因建立的副溶血弧菌实时-PCR方法对11种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论建立的方法能够特异和敏感地检测副溶血弧菌,并能确定致病性副溶血弧菌的毒力基因,能作为副溶血弧菌的灵敏和快速检测方法。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价

目的 基于多重聚合酶链反应（PCR）建立一种快速方便的检测副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的方法。方法 结合副溶血弧菌大流行菌群的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法。用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价。并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定。结果 副溶血弧菌大流行菌群有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带。而其他细菌扩增结果呈阴性。检测灵敏度可达到105 CFU/ml。对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌大流行菌群,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性。结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高。为副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持。     

荧光聚合酶链反应检测副溶血弧菌TLH与TDH

副溶血弧菌是引起我国沿海地区食物中毒的首要病原菌,主要致病因子是副溶血弧菌产生的溶血毒素,主要的溶血毒素有耐热性溶血毒素(TDH)和TDH相关的溶血毒素(TRH),此外,副溶血弧菌还可产生不耐热溶血毒素(TLH)。本实验采用TLH、TDH基因作为副溶血弧菌的靶序列,拟采用Taqman探针技     

副溶血弧茵感染分析

副溶血弧菌(Vibrio paLahaemolyticus,VP)是重要的嗜盐菌,广泛地分布于海洋和其他咸水环境中,并能以水和水生物等为媒介,引起人类胃肠炎或食物中毒.近年来.传统细菌性腹泻(沙门菌和志贺氏菌引起的腹泻)呈下降趋势,而副溶血弧菌引起的胃肠感染却逐年上升.为进一步调查本地区副溶血弧菌的感染状况,本文对我院肠道门诊所分离的副溶血弧菌进行了深入分析.     

副溶血弧菌的gyrB基因环介导的恒温扩增技术检测方法的研究

目的建立一种适合基层实验室应用和开展的快速检测副溶血弧菌的DNA环介导的恒温扩增法(LAMP)。方法针对副溶血弧菌的IgyrB/I 基因序列设计了4条引物（2条内引物、2条外引物）,并对扩增反应条件进行了优化。结果整个检测过程仅需1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检 测判断结果;对3株种系背景明确的副溶血弧菌不同实验对照株、23株副溶血弧菌地方分离株和32株其他肠道菌进行了检测,具有很高的特异性 ;该方法的最低检测限为24 cfu/ml,具有良好的敏感性;应用于61份贝类海产品的现场检测,阳性率为100%,与实时荧光定量PCR方法的检测 结果相符,阳性率高于传统的培养鉴定方法。结论本方法具有快速、灵敏、特异、简便、经济等特点,适合基层实验室、应急检测或现场监测 等使用,具有较高的推广价值。     

2016-2020年上海市松江区腹泻患者副溶血弧菌耐药性与分子分型研究

目的 了解上海市松江区腹泻患者副溶血弧菌的毒力基因、耐药性和分子分型等,为预防食源性疾病提供科学依据.方法 参照WS 271-2007进行副溶血弧菌的检测和分离,并应用微量肉汤法进行药物敏感性试验,采用PCR方法检测毒力基因,并对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型.结果 2016-2020年采集腹泻患者肛拭子标...     

浙江湖州地区2017-2020年食源性腹泻患者来源副溶血弧菌特征分析

摘要:目的回顾性分 析浙江湖州地区2017- -2020 年食源性腹泻患者分离的副溶血弧菌毒力基因血清分型及药敏特征,为当地副溶血弧菌的防治提供科学依据。方法收 集浙江省湖州市5家医院食源性腹泻就诊患者粪便中分离的181株副溶血. 弧菌,采用副溶血弧菌0、K血清试剂对181株副溶血弧菌进行分型,PCR法检测其毒力基因( tdh、trh、th和T3SSI、T3SS2)和遗传标志基因( toxRS/new、orf8) ,K-B法检测20种临床常用抗菌药物耐药性。结果浙江湖 州地区副溶血弧菌在7.8月份检 出最高[ 56.34%( 102/181)],感染人群以青壮年(>20岁且≤40岁)为主[15.86%(83/181)]。181 株副溶血弧菌主要血清型为03:K6型,占53.6%(97/181)。181株副溶血弧菌均携带th,164株携带tdh,179株携带T3SSI,167株携带T3SS2a基因,1 株携带trh基因,未检出携带T3SS2β基因;130株为大流行菌株,51株为非大流行菌株。181 株对氨苄西林( AMP)、哌拉西林(PRL)、阿米卡星(AK)、庆大霉林(CN)、头孢呋辛(CXM)耐药性相对较高,分别为100% 、25.44%、20.12% .11.83%、10.06% ,所有菌株对哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、亚胺培南(IPM)、美罗培南( MEM)、左氧氟沙星(LEV)、环丙沙星(CIP)、四环素(TE)、氣霉素(C)均100%敏感。结论浙江湖州地区 食源性腹泻患者副溶血弧菌感染有着明显的季节规律,感染人群以青 壮年为主,毒力基因携带率高,大多数为大流行菌株,主要血清型为03:K6型,总体对抗茵药物耐药率不高,不同的抗菌药物呈现不同的抗菌活性。     

基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究

目的利用规律间隔性成簇短回文重复序列（CRISPR）免疫原理及Cas12a酶的特点构建一种快速检测副溶血弧菌（VP）的方法,实现对病原菌准确快速的检测和识别。方法本研究通过制备纯化Cas12a蛋白,筛选构建VP的gRNA,建立CRISPR-VP荧光检测系统,根据最终荧光扩增曲线判定CRISPR-VP检测方法的有效性。结果在CRISPR-VP检测方法中只在VP的序列存在时才会产生明显的荧光信号。结论本实验初步建立了基于CRISPR/Cas蛋白的VP的检测方法,为后续简易检测试剂的研制提供理论依据。     

荧光聚合酶链反应检测副溶血弧菌TLH与TDH

副溶血弧菌是引起我国沿海地区食物中毒的首要病原菌，主要致病因子是副溶血弧菌产生的溶血毒素，主要的溶血毒素有耐热性溶血毒素（TDH）和TDH相关的溶血毒素（TRH），此外，副溶血弧菌还可产生不耐热溶血毒素（TLH）。本实验采用TLH、TDH基因作为副溶血弧菌的靶序列，拟采用Taqman探针技术定量检测副溶血弧菌。     

tdh+与tdh?副溶血弧菌耐药表型与基因型差异分析

  目的  描述tdh+与tdh?副溶血弧菌表型与基因型耐药差异,分析耐药基因型与耐药表型之间的关系。  方法  采用K-B纸片法检测208株tdh+与73株tdh?副溶血弧菌对临床及水产养殖中常用的7类16种抗生素的敏感性,使用新一代测序技术获得实验菌株的全基因序列,通过序列比对分析基因组中耐药基因及耐药相关基因突变情况。 分析耐药表型与基因型之间的关系。  结果  tdh+菌株和tdh?菌株对亚胺培南均100%敏感。 tdh+菌株对头孢吡肟、阿奇霉素耐药率（0.48%、8.65%）高于tdh?菌株（0.00%、4.11%）;tdh?菌株对氨苄西林、头孢西汀、头孢曲松、环丙沙星、萘啶酸、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑、复方新诺明、四环素、多西环素、氯霉素耐药率均高于tdh+菌株。 tdh?菌株的多重耐药率（34.25%）高于tdh+菌株（19.23%）。 耐药基因共检出5类7种,其中β-内酰胺类bla_CARB基因在所有的tdh+菌株和tdh?菌株均检出;四环素类tet（34）基因在tdh+与tdh?菌株基因携带率分别为99.52%、98.63%;喹诺酮类耐药基因qnrS5 仅在tdh+菌株中检出;tdh?菌株中叶酸代谢抑制类（sul2）、四环素类［tet（35）、tet（59）］、苯丙醇类（floR）耐药基因检出率高于tdh+菌株。 共在14株（tdh+9株,tdh?5株）细菌中检索出6种耐药基因点突变方式,均为编码16S rRNA的rrs基因突变。  结论  tdh?副溶血弧菌耐药现象较tdh+副溶血弧菌更为严重; 16S rRNA的rrs基因突变是除aph（3'）-Ib、aac（3）-Ⅱ、aac（6’） -I、aph（3'）-Id等耐药基因外副溶血弧菌对氨基糖胺类药物耐药的主要机制之一;副溶血弧菌中,可用bla_CARB耐药基因存在情况预测副溶血弧菌氨苄西林耐药表型;除此之外其余抗生素耐药表型与其对应耐药基因之间未见明确的对应的关系。     

两种核酸检测法在副溶血性弧菌耐热直接溶血素和不耐热溶血毒素中的应用评估

目的 比较CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测副溶血性弧菌（VP）的tlh种特异性基因和tdh毒力基因的灵敏度与特异性。方法 采用CPA-核酸试纸条法和荧光定量PCR法同时对655株不同来源的VP菌株进行tlh、tdh基因检测。结果 CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测结果相同,VP菌株的tlh基因检测阳性率均为100%（655/655）。两种方法对tdh基因的检测结果也完全一致,tdh基因临床株与海产品株阳性检测率均分别为95.8%（207/216）与2.27%（10/439）。CPA-核酸试纸条法对tlh、tdh基因检测具有高度特异性,灵敏度可达6.2103 cfu/ml菌液,从核酸制备至完成检测最快仅需1 h。结论 VP临床株与涉水产品分离株普遍携带tlh种特异性基因,而tdh毒力基因主要存在于临床标本而在涉水产品株极少存在,可采用敏感、特异的CPA-核酸试纸条法,做VP腹泻患者的床边诊断以及食物中毒事故现场的快速检测。     

2018-2020年浙江省湖州市食源性疾病监测结果分析

  目的   了解浙江省湖州市食源性疾病的感染状况和流行病学特征。  方法   收集湖州市2018 — 2020年6家食源性疾病监测哨点医院（重点监测点和常规监测点各3家）上送的沙门菌、副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌、志贺菌分离菌株,再对分离菌株进行血清分型和毒力基因检测;采用real-time PCR方法进行诺如病毒核酸检测。  结果   共检测6783 例腹泻病例标本,检出病原体1373份,检出率为20.24%。 致泻性大肠埃希菌检出率为6.49%,主要以肠聚集性大肠埃希菌和产肠毒素大肠埃希菌为主;副溶血弧菌检出率5.31%,血清分型以 O3∶K6 为主,毒力基因以tdh 为主;沙门菌检出率为2.85%,以鼠伤寒沙门菌为主;诺如病毒阳性率为11.65%,基因型别以GⅡ.2［P16］为主。 致病菌引起的发病高峰在夏季,诺如病毒引起的发病高峰在冬春季, 20～39岁为主要感染人群。  结论   2018 — 2020年引起湖州市感染性腹泻的病原体为诺如病毒、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌和沙门菌,发病呈现明显的季节性和年龄分布。 应加强对食源性病原体的监测,有效控制食源性疾病的发生。     

2016-2019年江苏省南京市人感染副溶血弧菌分子特征分析

  目的  了解江苏省南京市副溶血弧菌临床分离株的分子特征,为其防控提供参考。  方法  收集2016—2019年从腹泻和食物中毒患者分离的副溶血弧菌临床分离株并进行血清型分型,运用聚合酶链式反应（PCR）方法检测菌株的tlh、tdh、trh、toxRS/new、ORF8五种毒力基因,采用多位点序列分型（MLST）对菌株进行分子分型分析。  结果  2016—2019年共收集93株临床分离株,菌株优势血清型为O3∶K6（65/93,69.9%）,均携带tlh基因,73株属于tdh+trh- toxRS/new+的大流行菌群,非大流行菌群菌株中有5株为tdh-trh-非致病株。 共检出13个ST型,以ST3为主（68/93,73.1%）。  结论  南京地区副溶血弧菌以O3∶K6、ST3型大流行菌群菌株为主,非大流行菌群、非致病株并存。     

北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断病例的感染致病菌检测分析

  目的  分析北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断病例的感染致病菌构成及病原特征,为该类疾病的科学防控提供依据。  方法  收集细菌性痢疾临床诊断病例44例,进行志贺菌属、弯曲菌属、沙门菌属、副溶血弧菌、霍乱弧菌、致泻大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌7种常见致病菌的分离培养,对分离菌株进行血清分型、分子分型及毒力基因检测。  结果  志贺菌属和小肠结肠炎耶尔森菌检出率为0,其他致病菌检出率由高到低依次为弯曲菌属（30.00%,9/30）、沙门菌属（18.18%,8/44）、副溶血弧菌（15.91%,7/44）、致泻大肠埃希菌（4.55%,12/44）、霍乱弧菌（3.13%,1/32）。 9株空肠弯曲菌分成9种ST型;8株沙门菌分成4种血清型,7种脉冲电场凝胶电泳带型;8株副溶血弧菌分成4种血清型,毒力基因特征均为tdh+/trh-;1株霍乱弧菌为非O1/O139血清型,毒力基因特征为ctx-/t3ss+。  结论  北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断错误率较高。 细菌性痢疾临床诊断病例具有较高的致病菌检出率,以弯曲菌属、沙门菌属为优势构成。 志贺菌属与其他腹泻肠道致病菌的快速鉴别诊断应在临床尽快建立并推广应用。     

2013－2018年浙江省杭州市腹泻样本中O4血清群副溶血弧菌分子特征分析

  目的  分析浙江省杭州市腹泻样本中O4血清群副溶血弧菌分子特征。   方法  对2013—2018年杭州市腹泻样本中分离的1 061株副溶血弧菌进行血清凝集分析,采用qPCR方法检测其中147株O4血清群副溶血弧菌的耐热直接溶血素（tdh）、耐热相关溶血素（trh）、不耐热溶血素（tlh）和toxRS/new基因,并用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法进行分子分型。   结果  血清型为O4∶KUT（87.07%, 128/147）、O4∶K8（10.20%, 15/147）和O4∶K9（2.72%, 4/147）的菌株均为tdh+trh-tlh+toxRS/new-基因型。 根据PFGE图谱,菌株可以分成PA（以2016年后分离的菌株为主）和PB（2013—2018年菌株）2个簇,分别包含15和16个不同带型。 其中O4∶K8菌株均处于PA簇,O4∶K9菌株均处于PB簇,O4∶KUT菌株分布于PA和PB簇中。   结论  近年来杭州市分离自腹泻患者的O4∶KUT血清型菌株存在2个流行克隆群。 其中PB簇O4∶KUT菌株持续存在,PA簇O4∶KUT菌株在2016年出现并引起本地散在暴发,该型别菌株有成为地区流行克隆群的可能。     

全基因组数据应用于多克隆副溶血弧菌感染暴发的病原学分析

目的应用实时荧光PCR方法和基因组重测序分析等技术对一起副溶血弧菌（VP）导致的腹泻暴发事件进行病原学分析。方法收集暴发事件的病例信息,采集病例样本,使用实时荧光PCR方法筛选常见腹泻致病菌,分离鉴定VP并进行血清型鉴定,检测菌株毒力基因,采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗菌药物的敏感性,使用全基因组测序技术进行菌株的遗传学分析。结果9份肛拭子共分离出13株VP菌株,其中O4∶KUT血清型7株（trh–/tdh+）,O1∶KUT血清型6株（5株trh+/tdh+,1株trh–/tdh–）。在检测的30种抗菌药物中,所有菌株仅对氨苄西林耐药,对其他29种抗菌药物均敏感。在基于全基因组序列的遗传学分析中,13株VP形成4个相互独立且遗传距离较远的分支,Lineage 1（O4∶KUT、trh–/tdh+,2株）、Lineage 2（O1∶KUT、trh–/tdh–,1株）、Lineage 3（O1∶KUT、trh+/tdh+,5株）和Lineage 4（O4∶KUT、trh–/tdh+,5株）,其中3例患者由来源于3个不同遗传分支的VP混合感染。结论本次事件由多血清型、多克隆的VP感染导致,基因组重测序技术在腹泻病暴发的病原分析中有较好的应用前景。     

宏基因组测序在腹泻暴发调查中的应用

  目的  评价宏基因组测序技术在腹泻暴发中的潜在应用价值。  方法  收集2017年报告的2例聚集性腹泻暴发事件的样品,针对样品进行多重荧光PCR检测;同时,应用宏基因组测序技术对样品进行测序,基于测序数据分析暴发事件的病原体。  结果  案例1采用多重荧光PCR检测,仅检测到副溶血弧菌;而采用宏基因组测序技术除检测到副溶血弧菌外,还检测到更高丰度的沙门菌。案例2采用多重荧光PCR未检测到病原体的样品,采用宏基因组测序技术检测到了志贺菌。  结论  宏基因组测序不需先验知识进行预判,可以避免引入误判,更有利于发现混合感染,而且在保证足够测序深度的情况下,可以获得比荧光PCR法更高的检测灵敏度。