实时荧光PCR方法分型检测细菌16S rRNA基因的临床应用

目的建立快速、准确、特异的检测细菌16S rRNA基因的实时荧光PCR法。方法根据Taq Man探针技术实时荧光PCR反应原理结合细菌16S rRNA基因序列,在高保守区域设计通用引物和特异性探针,对10种标准菌株及15种临床培养分离菌株进行PCR检测,优化反应体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,并对187份标本采用培养法和实时荧光PCR法进行检测比较。结果 10种标准株和15种临床培养株采用通用引物检测全阳性,9株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针检测全阳性,16株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针检测也全阳性。187例临床标本经实时荧光PCR检测阳性率为16.22%(30/185),培养法检出率为9.73%(18/185),2种方法革兰菌分型结果一致,细菌检出率前者明显高于后者,差异有统计学意义(P0.05)。结论多探针实时荧光PCR法检测细菌16S rRNA具有敏感性高、特异性强、方便快捷等特点,可在细菌感染性疾病中给临床医生提供更全面的病原学资料,早期指导抗生素的应用。     

葡萄酒中酒香酵母实时荧光PCR检测方法的研究

目的建立葡萄酒中酒香酵母实时荧光PCR检测方法。方法将滴度为3.0×10~6cfu/ml、3.0×10~5cfu/ml、3.0×10~4cfu/ml、3.0×10~3cfu/ml、3.0×10~2cfu/ml、30 cfu/ml的1 ml菌液加至45 ml酒样中,离心洗涤后利用碱裂解法提取DNA,进行实时荧光PCR检测,测定检测方法的灵敏度;提取革兰阳性细菌、革兰阴性细菌以及5株葡萄酒中相关菌株(包含1株酒香酵母等效菌株)的DNA,进行实时荧光PCR检测,测定检测方法的特异性。结果该实时荧光PCR方法的定量限为6.67 cfu/ml,检出限为0.67 cfu/ml;该方法对酒香酵母及其等效菌株均可检出,对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌以及其余相关菌株均无交叉反应。结论该实时荧光PCR方法灵敏度高、特异性好,可准确快速地检测出葡萄酒中的酒香酵母菌。     

实时荧光定量PCR快速检测细菌对抗菌素敏感性与耐药性表型的方法建立

目的 建立快速检测细菌对抗菌素的敏感性与耐药性表型的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。方法 用基于细菌16S rRNA基因通用引物和通用探针的qPCR检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株基因组DNA,绘制生长曲线以确定细菌显著生长的最短培养时间。计算细菌在含和不含抗菌素的M-H肉汤中的相对生长率,以VITEK 2 Compact 全自动细菌分析系统的药敏结果为金标准,对细菌相对生长率进行ROC曲线分析,确定区分细菌对抗菌素敏感与耐药的相对生长率分界值。用20株肠杆菌科细菌和10株革兰阳性球菌临床分离菌株验证方法的可靠性。结果 细菌显著生长的最短培养时间为3小时。区分大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对抗菌素敏感与耐药的相对生长率分界值分别为0.44、0.40和0.48本方法检测30株大肠埃希菌对3种抗菌素的敏感性和耐药性的准确度分别为98.4%和100.0%,30株金黄色葡萄球菌对3种抗菌素的敏感性和耐药性的准确度均为100.0%,30株铜绿假单胞菌对3种抗菌素敏感性和耐药性的准确度分别为60.0%和64.0%。20株肠杆菌科细菌和10株革兰阳性球菌对抗菌素的敏感性与耐药性结果的总准确度分别为92.7%和93.3%。结论 本方法能快速准确为临床提供肠杆菌科细菌和革兰阳性球菌对抗菌素的敏感性与耐药性表型,但对非发酵菌药敏结果的准确性不能满足临床要求。     

实时荧光定量PCR检测痰标本中军团菌属

目的建立荧光定量PCR方法,用于检测军团菌属特异性16S rRNA基因,并探讨广州地区军团菌属感染状况。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,对广东省中医院采集的532例肺部感染患者痰液标本进行检测。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属细菌检测结果均为阴性;检测灵敏度为102CFU/ml,临床检测532例肺部感染患者的痰液标本,荧光法检出军团菌阳性43例,阳性率为8.08%,16S rRNA PCR法加基因测序验证阳性率为7.71%,两者检测结果差异无统计学意义,表明其具有较好的符合性和等效性。结论 16S rRNA基因荧光定量PCR法检测患者痰液标本中军团菌属,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌属感染调查及快速检测。     

血液透析液和透析用水中细菌污染状况的研究

目的研究血液透析液和透析用水中细菌及革兰阴性菌的污染状况。方法采用改良胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA)平板涂布法定量测定血液透析液和透析用水中革兰阴性污染菌数量、VITEK2鉴定仪进行菌种鉴定,营养琼脂倾注法检测血液透析液和透析用水中污染菌菌落总数。结果 17份血液透析用水污染菌平均菌落总数为19cfu/ml,革兰阴性污染菌的平均菌落数为7cfu/ml,61份入口处血液透析液污染菌平均菌落总数为122cfu/ml,其中革兰阴性污染菌平均菌落数为54cfu/ml;61份出口处血液透析液污染菌平均菌落总数为307cfu/ml,其中革兰阴性污染菌平均菌落数为174cfu/ml,透析液革兰阴性污染菌和污染菌菌落总数入口处、出口处均存在显著性差异(P0.05)。本文检出的革兰阴性污染菌主要有普罗威登菌、肠杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、假单胞菌和不动杆菌属等机会致病菌。结论血液透析液有一定程度革兰阴性菌污染,透析用水和透析液存在操作污染或系统自身污染。     

长滩军团菌荧光原位杂交探针的设计研究

目的设计一条特异性的长滩军团菌荧光原位杂交探针,并验证其特异性与敏感度,初步建立长滩军团菌的荧光原位杂交检测法。方法以长滩军团菌16S rRNA特异性位点设计杂交探针。在数据库中对探针序列进行特异性检验,优化反应条件,以军团菌标准菌株和环境分离菌株验证探针的特异性,并以模拟水样验证探针灵敏度。结果生物信息学分析表明,设计的探针LEG long序列与长滩军团菌16S rRNA序列完全配对,与其他军团菌种均存在1个碱基以上的错配。菌株验证实验证明LEG long探针可与长滩军团菌的标准菌株和环境分离株特异性杂交,与其他军团菌种和非军团菌属菌株无杂交信号。探针检测灵敏度可达1.49×103 CFU/ml。结论本研究设计的探针LEG long可用于长滩军团菌的高特异性和高灵敏度检测。     

检测5种碳青霉烯酶基因的多重PCR方法的建立及临床应用

目的建立并评价一种多重降落PCR(Multiplex Touchdown PCR,MT-PCR)方法检测5种碳青霉烯酶基因。方法收集东部战区总医院保存的42株耐碳青霉烯类菌株和合成的带有OXA-48部分基因质粒,建立5种碳青霉烯酶基因的多重降落PCR方法,分析其特异性、敏感性,并收集东部战区总医院临床微生物实验室送检的临床无菌体液标本67份及其分离菌株36株进行临床应用评价。结果 MT-PCR可用于5种碳青霉烯酶基因的检测,对blaOXA-48、blaVIM和blaKPC检测限均为200 CFU/ml,而对blaIMP与blaNDM的检测限为2×10~3 CFU/ml。42株临床分离菌株的MT-PCR检测结果与单重PCR检测结果完全一致。以抗菌药物药敏试验为参考方法,67个无菌体液标本的MT-PCR结果与药敏试验结果差异无统计学意义(P=0.125),且敏感性和特异性分别为80.00%和100.00%。结论 MT-PCR方法能有效地用于临床分离物和无菌体液标本中的碳青霉烯酶基因检测。     

微型寡核苷酸芯片检测脑脊液病原菌研究与应用

目的建立快速检测脑脊液标本中常见病原菌的微型寡核苷酸芯片。方法根据脑脊液中常见病原菌16S rRNA基因序列设计通用引物和检测探针;探针固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片;通用引物扩增病原菌DNA并标记生物素,产物与芯片进行反向杂交检测;对该体系的敏感性和特异性进行了测试,并检测了32例临床病原菌感染的脑脊液标本。结果所有实验菌株均只与芯片上相应探针杂交。该法最低可检测出10 CFU/ml的大肠埃希菌;32例临床本的检测结果与常规鉴定法完全一致。结论该寡核苷酸芯片法能够准确、敏感、快速地检测脑脊液标本中的病原菌。     

贵州省死亡病例1型猪链球菌的分离及分子生物学特征分析

目的 对来自贵州省1例疑似人感染猪链球菌患者的血液标本进行细菌分离鉴定,了解该菌株的分子生物学特征,为病例的快速确诊提供病原学依据。方法 采用血培养法对疑似感染猪链球菌患者的血液进行细菌分离培养,对分离菌株采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增和DNA序列测定,将测序结果通过GenBank数据库的BLAST程序进行在线比对,再用猪链球菌种特异的16S rRNA 基因进行猪链球菌种的鉴定,进一步分别采用PCR检测常见强致病性血清型1、2、7和9型特异的cps 1j、cps 2j、cps 7h和cps9h基因以鉴定其血清型,并对菌株毒力基因gapdh、mrp、sly和ef进行检测。结果 血培养分离出1株链球菌可疑菌株,序列比对结果显示该分离菌株16S rRNA基因与猪链球菌的同源性最高,进一步的猪链球菌特异性PCR检测显示分离菌株16S rRNA基因为阳性,血清型特异PCR检测结果显示cps 1j基因为阳性,而cps 2j、cps 7h和cps 9h基因为阴性,毒力基因检测结果显示分离菌株gapdh,sly和ef毒力基因为阳性,而mrp为阴性。结论 本次从疑似感染猪链球菌死亡病例分离的菌株为猪链球菌1型,其毒力特征为gapdh、sly和ef基因阳性,mrp基因阴性,该病例为1型猪链球菌感染所致,且菌株毒力较强。     

胶体金免疫层析试纸快速灵敏检测沙门菌

目的建立快速、灵敏检测沙门菌的免疫层析试纸方法。方法根据沙门菌的16S DNA序列设计引物进行PCR扩增,并根据PCR产物设计2种特异性探针(探针B和探针F),分别在其5'端和3'端标记Biotin和FAM。PCR产物与探针杂交后应用于免疫层析试纸条。当检测有沙门菌时试纸条会出现2条红线,当没有沙门菌会出现1条红线。对探针的浓度进行优化后,检测沙门菌以及其他7种细菌分析该方法的特异性,并检测不同浓度(107cfu/ml~101cfu/ml)的沙门菌,分析其灵敏度。结果探针的最优浓度为1μmol/L,检测除沙门菌外的其他7种细菌,结果均显示阴性,检测沙门菌的最低浓度为10~2cfu/ml。结论该实验方法的灵敏度高、特异性好,适用于检测沙门菌,有良好的应用性。     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。     

PCR检测粪便中志贺菌

目的 建立一种粪便样本中快速、特异、敏感的志贺菌检测方法 .方法 运用PCR对痢疾、福氏、鲍氏和宋内4群志贺菌进行侵袭性质粒H抗原(ipaH)基因的检测,并对该PCR方法 进行反应的灵敏度、特异性以及模拟粪便样品的最低检出限测定.结果 4群志贺菌均能检出侵袭性质粒H抗原(ipaH)基因,纯菌检测灵敏度达102cfu/ml,特异性实验中志贺菌菌株PCR扩增均为阳性,阴性对照菌株未扩增出特异性条带,混合菌株PCR扩增均为阳性;接种志贺菌到粪便样品中,当粪便样本中菌量达104 cfu/ml以上时,不需要增菌,志贺菌均可立即检出.结论 PCR方法 检测志贺菌灵敏度高、快速、特异性强,可以很好地应用于粪便等临床样本中志贺菌的检测与鉴定.     

用最低检出限评价大肠埃希菌O157:H7的检测方法及应用研究

目的用最低检出限评价大肠埃希菌O157:H7的三种检测方法,在突发公共卫生事件及食源性致病菌流行病学调查中,将大肠埃希菌O157:H7的检测方法有机组合,提高检测的速度、灵敏度。方法将标准菌株10倍稀释,制备模拟样品,用大肠埃希菌O157:H7的三种方法进行检测,比较不同检测方法的最低检出限。结果标准菌株10倍稀释改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的最低检出限分别为103、100、102cfu/ml;模拟样品中增菌前改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的最低检出限分别为105、101、104cfu/ml,增菌培养后改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的最低检出限分别为102、100、100cfu/ml。结论免疫磁珠分离法在增菌前和增菌培养后的检出限为最低,增菌培养后实时荧光PCR法的检出限也达到了最低,适用于食物中毒及食源性疾病的快速诊断。用改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法进行检测,易造成漏检。将免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法有机组合,可以大大提高检测的速度,灵敏度,并且可获得菌株。     

呼吸道感染患者分离奈瑟菌属菌种的生物学与16S rRNA鉴定

目的 了解引起呼吸道感染的常见致病性奈瑟菌属菌种以及从慢性呼吸道感染患者分离的致病性奈瑟菌属的鉴定方法.方法 采集249例不同年龄慢性呼吸道感染患者的痰标本,分别进行革兰染色镜检和接种血琼脂培养基分离培养;分离的奈瑟菌样革兰阴性双球菌,分别进行常规细菌学方法和染色体16S rRNA基因检测鉴定以及药物敏感(K-B法)试验.结果 在184例患者的痰标本内分离出227株.占73.9％,呈明显优势生长甚至惟一生长的革兰阴性双球菌,常规细菌学方法鉴定分别为干燥奈瑟菌、黏液奈瑟菌、微黄奈瑟菌、金黄奈瑟菌、多糖奈瑟菌、嗜乳糖奈瑟菌、脱氨奈瑟菌及灰色奈瑟菌;各菌种通过16S rRNA基因PCR检测和序列测定,发现与常规细菌学方法鉴定的符合率＞64.0％;来自不同患者的各种奈瑟菌对临床常用抗菌药物的敏感性相似,存在许多耐药或多药耐药菌株.结论 人体上呼吸道正常菌群奈瑟菌属的许多菌种,是引起呼吸道感染患者慢性继发性呼吸道感染的常见致病菌,这些菌种的生物学特性及其广泛的耐药性,使其成为影响慢性呼吸道感染的病原学诊断与治疗效果的重要因素,常规细菌学与16S rRNA检测相结合,能够提高呼吸道条件致病性奈瑟菌鉴定的准确率.     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

喉癌术后患者医院感染的病原菌分布及耐药性分析

目的 观察喉癌术后患者医院感染的临床特点,为临床工作提供支持.方法 回顾性分析54例喉痛术后感染患者的临床资料,统计其医院感染发生部位、致病菌种类及其耐药率、预后的影响.结果 54例患者中肺部感染36例,占66.67％,手术切口感染11例,占20.37％,泌尿系感染6例,占11.11％;共培养出病原菌87株,其中革兰阴性菌51株,占58.62％,革兰阳性菌28株,占32.18％,真菌8株,占9.20％;革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌对万古霉素高度敏感;革兰阴性菌中铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南高度敏感;住院时间长、年龄＞60岁患者且长期吸烟史、肾上腺皮质激素应用时间长及预防性应用抗菌药物是发生医院感染的危险因素;该组患者死亡10例,死亡率为18.52％.结论 喉癌围术期要严格无菌操作,临床应加强预防医院感染的管理,减少医院感染的发生;对感染的患者及时进行分泌物细菌培养及耐药性的检测,对指导临床合理用药具有重要意义.     

重症脑卒中后继发感染患者病原菌及预后的临床观察

目的 观察重症脑卒中后继发感染患者的病原菌、药敏率及预后的特点,为临床工作提供支持.方法 应用回顾性研究,观察181例重症脑卒中后继发感染的患者,进行病原菌种类统计,观察药敏情况及预后的影响.结果 181例重症脑卒中后继发医院感染患者,其中发生肺部感染146例,泌尿系感染19例,其他感染16例；共检出病原菌183株,主要为真菌55株占30.5％,克雷伯菌属39株占21.3％和大肠埃希菌32株占17.5％；克雷伯菌属对亚胺培南的敏感率为97.4％,大肠埃希菌对亚胺培南的敏感率为100.0％；患者不同住院时间医院感染率,差异有统计学意义(P＜0.05)；死亡17例.结论 重症脑卒中后继发感染临床多见,临床治疗及护理中要严格无菌操作,对感染患者及时进行细菌培养及耐药性检测,对指导临床合理用药具有重要意义.     

应用通用引物PCR检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值

目的了解细菌和真菌性中枢神经系统（CNS）感染病原谱,并探讨通用引物聚合酶链反应（PCR)检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊CNS细菌或真菌性感染患者资料,分析其脑脊液培养病原菌种类,采用细菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物对患者脑脊液DNA进行PCR扩增和序列测定,并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似CNS细菌或真菌感染者400例,其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株,其中革兰阳性菌48株,革兰阴性菌90株,真菌12株;居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌（32株）、凝固酶阴性葡萄球菌（16株）和肺炎克雷伯菌（13株）;最常见真菌为新生隐球菌（8株）。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行PCR扩增,PCR扩增法灵敏度（35.23％,31/88）高于培养法（28.41%,25/88）（χ2＝4.17,P＜0.05）。PCR扩增和培养法阴性预测值分别为25.97%、24.10%,两种方法的特异度、阳性预测值均为100.00%。PCR扩增测序与培养结果符合率为84.00%（21/25）;PCR检测平均报告时间（48 h）较培养结果报告时间（细菌平均约72 h,真菌平均约96 h）更快速。结论CNS 感染病原分布广泛,以革兰阴性菌为主;通用引物PCR检测具有快速、灵敏、准确等特点,具有良好的临床推广和应用价值。